Name: vaccinia virus infection &amp; temporal analysis of virus gene expression: part 1
Uploaded: 2009-04-08T00:00:00
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Whitehead Institute Fellows Fundos

Parte 1: Configurando a infecção <ol><li> Cultivar células HeLa em frascos e espere até que as células são aproximadamente 80% confluentes. </li><li> Prepare o suficiente meio de crescimento viral para o experimento: DMEM regular com 2% FBS e sem antibióticos acrescentou. </li><li> A infecção pode ser realizada com o estoque bruto de um vírus vaccinia com um título conhecido, ou sacarose purificada vírus com um título conhecido, se você estiver preocupado com a expressão do gene host. </li><li> Se você...

<ol>
	<li>KH, R. u. b. i. n. s., LE, H. e. n. s. l. e. y., GW, B. e. l. l., Wang, C., EJ, L. e. f. k. o. w. i. t. z., PO, B. r. o. w. n., DA, R. e. l. m. a. n. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+of+viral+gene+expression+programs+during+poxvirus+infection:+a+transcriptional+map+of+the+vaccinia+and+monkeypox+genomes.">Comparative analysis of viral gene expression programs during poxvirus infection: a transcriptional map of the vaccinia and monkeypox genomes.</a> PLoS ONE. 3 (7), e2628-e2628 (2008).</li><li>Assarsson, E., Greenbaum, J. A., Sundstr&#246;m, M., Schaffer, L., Hammond, J. A., Pasquetto, V., Oseroff, C., Hendrickson, R. C., Lefkowitz, E. J., Tscharke, D. C., Sidney, J., Grey, H. M., Head, S. R., Peters, B., Sette, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetic+analysis+of+a+complete+poxvirus+transcriptome+reveals+an+immediate-early+class+of+genes.">Kinetic analysis of a complete poxvirus transcriptome reveals an immediate-early class of genes.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 105 (6), 2140-2145 (2008).</li><li>Satheshkumar, P. S., Moss, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Poxvirus+transcriptome+analysis.">Poxvirus transcriptome analysis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, E62-E62 (2008).</li><li>Assarsson, E., Greenbaum, J. A., Sundstr&#246;m, M., Schaffer, L., Hammond, J. A., Pasquetto, V., Oseroff, C., Hendrickson, R. C., Lefkowitz, E. J., Tscharke, D. C., Sidney, J., Grey, H. M., Head, S. R., Peters, B., Sette, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A.+Reply+to+Satheshkumar+and+Moss:+Poxvirus+transcriptome+analysis.">A. Reply to Satheshkumar and Moss: Poxvirus transcriptome analysis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, E63-E64 (2008).</li><li>Guerra, S., L&#243;pez-Fern&#225;ndez, L. A., Pascual-Montano, A., Mu&#241;oz, M., Harshman, K., Esteban, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+gene+expression+survey+of+vaccinia+virus+infection+of+human+HeLa+cells.">Cellular gene expression survey of vaccinia virus infection of human HeLa cells.</a> J Virol. 77 (11), 6493-6506 (2003).</li><li>Guerra, S., L&#243;pez-Fern&#225;ndez, L. A., Conde, R., Pascual-Montano, A., Harshman, K., Esteban, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microarray+analysis+reveals+characteristic+changes+of+host+cell+gene+expression+in+response+to+attenuated+modified+vaccinia+virus+Ankara+infection+of+human+HeLa+cells.">Microarray analysis reveals characteristic changes of host cell gene expression in response to attenuated modified vaccinia virus Ankara infection of human HeLa cells.</a> J Virol. 78 (11), 5820-5824 (2004).</li><li>Guerra, S., L&#243;pez-Fern&#225;ndez, L. A., Pascual-Montano, A., N&#225;jera, J. L., Zaballos, A., Esteban, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host+response+to+the+attenuated+poxvirus+vector+NYVAC:+upregulation+of+apoptotic+genes+and+NF-kappaB-responsive+genes+in+infected+HeLa+cells.">Host response to the attenuated poxvirus vector NYVAC: upregulation of apoptotic genes and NF-kappaB-responsive genes in infected HeLa cells.</a> J Virol. 80 (2), 985-998 (2006).</li><li>Guerra, S., N&#225;jera, J. L., Gonz&#225;lez, J. M., L&#243;pez-Fern&#225;ndez, L. A., Climent, N., JM, G. a. t. e. l. l., Gallart, T., Esteban, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+gene+expression+profiling+after+infection+of+immature+human+monocyte-derived+dendritic+cells+by+the+attenuated+poxvirus+vectors+MVA+and+NYVAC.">Distinct gene expression profiling after infection of immature human monocyte-derived dendritic cells by the attenuated poxvirus vectors MVA and NYVAC.</a> 81 (16), 8707-8721 (2007).</li></ol>

Passos crítica Parte 1 &amp; 2 Existem vários passos críticos para a criação de uma infecção vaccinia síncrona, a sonicação ser o primeiro cuidado (ou trypzinizing) do vírus, a fim de desagregar as partículas do vírus. Vaccinia é altamente propensos a agregar, e ruptura de partículas do vírus é importante para assegurar mesmo a infecção de células. A fim de alcançar uma infecção síncrono, uma alta MOI (superior a 2) deve ser usado para garantir...

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		<div>
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		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>TRIzol Reagent</td>
<td>Reagent</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>15596-026</td>
<td>Similar reagents, such as TriPure from Roche, will also work.</td>
</tr>
<tr>
<td>BCP Phase Separation Reagent</td>
<td>Reagent</td>
<td>Molecular Research Center</td>
<td>BP151</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>RNase-Free DNase Set</td>
<td>Reagent</td>
<td>Qiagen</td>
<td>79254</td>
<td>DNase treatment is an optional step.</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

vaccinia virus infection &amp; temporal analysis of virus gene expression: part 1

A família<em&gt; Poxviridae</em&gt; Consiste de DNA double-stranded grandes contendo vírus que se replicam exclusivamente no citoplasma das células infectadas. Membros da<em&gt; Orthopox</em&gt; Gênero incluem a varíola, o agente causador da varíola humana, macacos, e vaccinia (VAC), o membro protótipo da família de vírus. Dentro do relativamente grande (~ 200 kb) vaccinia genoma, três classes de genes são codificados: precoce, intermediária e final. Enquanto todas as três classes são transcritos pela polimerase viral codificado RNA, cada classe tem uma função diferente no ciclo de vida do vírus. Poxvírus utilizar múltiplas estratégias para a modulação do ambiente celular do hospedeiro durante a infecção. A fim de compreender a regulação de ambos os host e expressão do gene do vírus, nós utilizamos genome-wide abordagens para analisar a abundância transcrição de ambos os vírus e células hospedeiras. Aqui, demonstramos infecções tempo de percurso de células HeLa com Vaccinia vírus RNA e amostragem em vários intervalos de tempo pós-infecção. Ambos os host e viral RNA total é isolado e amplificado para a hibridização de microarrays para a análise da expressão gênica.

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Vaccinia Virus Infection & Temporal Analysis of Virus Gene Expression: Part 1

Protocolo para Vaccinia infecção de células HeLa e análise de host e expressão gênica viral. Parte 1 de 3.

Infecção pelo Vírus Vaccinia e Análise Temporal da Expressão Gênica de Vírus: Parte 1

The family Poxviridae consists of large double-stranded DNA containing viruses that replicate exclusively in the cytoplasm of infected cells.  Members of ...

Research

JoVE Journal

Biology

Vaccinia Virus Infection &amp; Temporal Analysis of Virus Gene Expression: Part 1

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The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

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It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

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Infecção pelo Vírus Vaccinia e Análise Temporal da Expressão Gênica de Vírus: Parte 3

Using the Gene Pulser MXcell Electroporation System to Transfect Primary Cells with High Efficiency

Usando o Sistema de Eletroporação Gene Pulser MXcell para transfectar pilhas com Alta Eficiência

Using an Automated Cell Counter to Simplify Gene Expression Studies: siRNA Knockdown of IL-4 Dependent Gene Expression in Namalwa Cells

Usando um contador de células automatizadas para simplificar Estudos da Expressão Gênica: Knockdown siRNA de Expressão IL-4 Gene Dependente em células NAMALWA

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only ...

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

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Na reconstituição in vitro da atividade T. Telomerase castaneum

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more ...

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Cotton (Gossypium hirsutum) is one of the most important crops worldwide. Considerable efforts have been made on molecular breeding of new varieties.  The ...

Chemically-blocked Antibody Microarray for Multiplexed High-throughput Profiling of Specific Protein Glycosylation in Complex Samples

Microarray de anticorpos quimicamente bloqueada para Multiplexed perfil de alta capacidade de glicosilação proteína específica em amostras complexas

 In this study, we describe an effective protocol for use in a multiplexed high-throughput antibody microarray with glycan binding protein detection that ...

The MultiBac Protein Complex Production Platform at the EMBL

A Plataforma de Produção de Proteína Complexo MultiBac no EMBL

Proteomics  research revealed the impressive complexity of eukaryotic proteomes in  unprecedented detail. It is now a commonly accepted notion that ...