Name: vaccinia virus infection &amp; temporal analysis of virus gene expression: part 2
Uploaded: 2009-04-10T00:00:00
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Los becarios del Instituto Whitehead Fondos

Parte 1: síntesis de cDNA a partir de ARN <ol><li> Antes de utilizar el Ambion Amino alil MessageAmp II kit, añadir el volumen recomendado de etanol al 100% a los tampones de lavado. </li><li> En el tubo de reacción de PCR, añadir entre 100 ng de ARN total de 5μg y 1μl de T7 oligo (dT) primer. Llevar el volumen hasta 12μl con agua libre de nucleasa. </li><li> Incubar las muestras a 70 ° C durante 10 minutos en un termociclador. </li><li> Extraer muestras de ARN de 70 ° C y centrifugar brevemente. Coloque sobr...

<ol>
	<li>Rubins, K. H., Hensley, L. E., Bell, G. W., Wang, C., Lefkowitz, E. J., Brown, P. O., Relman, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+of+viral+gene+expression+programs+during+poxvirus+infection:+a+transcriptional+map+of+the+vaccinia+and+monkeypox+genomes.">Comparative analysis of viral gene expression programs during poxvirus infection: a transcriptional map of the vaccinia and monkeypox genomes.</a> PLoS ONE. 3 (7), e2628-e2628 (2008).</li><li>Assarsson, E., Greenbaum, J. A., Sundstr&#246;m, M., Schaffer, L., Hammond, J. A., Pasquetto, V., Oseroff, C., Hendrickson, R. C., Lefkowitz, E. J., Tscharke, D. C., Sidney, J., Grey, H. M., Head, S. R., Peters, B., Sette, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetic+analysis+of+a+complete+poxvirus+transcriptome+reveals+an+immediate-early+class+of+genes.">Kinetic analysis of a complete poxvirus transcriptome reveals an immediate-early class of genes.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 105 (6), 2140-2145 (2008).</li><li>Satheshkumar, P. S., Moss, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Poxvirus+transcriptome+analysis.">Poxvirus transcriptome analysis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, E62-E62 (2008).</li><li>Assarsson, E., Greenbaum, J. A., Sundstr&#246;m, M., Schaffer, L., Hammond, J. A., Pasquetto, V., Oseroff, C., Hendrickson, R. C., Lefkowitz, E. J., Tscharke, D. C., Sidney, J., Grey, H. M., Head, S. R., Peters, B., Sette, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A.+Reply+to+Satheshkumar+and+Moss:+Poxvirus+transcriptome+analysis.">A. Reply to Satheshkumar and Moss: Poxvirus transcriptome analysis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, E63-E64 (2008).</li><li>Guerra, S., L&#243;pez-Fern&#225;ndez, L. A., Pascual-Montano, A., Mu&#241;oz, M., Harshman, K., Esteban, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+gene+expression+survey+of+vaccinia+virus+infection+of+human+HeLa+cells.">Cellular gene expression survey of vaccinia virus infection of human HeLa cells.</a> J Virol. 77 (11), 6493-6506 (2003).</li><li>Guerra, S., L&#243;pez-Fern&#225;ndez, L. A., Conde, R., Pascual-Montano, A., Harshman, K., Esteban, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microarray+analysis+reveals+characteristic+changes+of+host+cell+gene+expression+in+response+to+attenuated+modified+vaccinia+virus+Ankara+infection+of+human+HeLa+cells.">Microarray analysis reveals characteristic changes of host cell gene expression in response to attenuated modified vaccinia virus Ankara infection of human HeLa cells.</a> J Virol. 78 (11), 5820-5824 (2004).</li><li>Guerra, S., L&#243;pez-Fern&#225;ndez, L. A., Pascual-Montano, A., N&#225;jera, J. L., Zaballos, A., Esteban, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host+response+to+the+attenuated+poxvirus+vector+NYVAC:+upregulation+of+apoptotic+genes+and+NF-kappaB-responsive+genes+in+infected+HeLa+cells.">Host response to the attenuated poxvirus vector NYVAC: upregulation of apoptotic genes and NF-kappaB-responsive genes in infected HeLa cells.</a> J Virol. 80 (2), 985-998 (2006).</li><li>Guerra, S., N&#225;jera, J. L., Gonz&#225;lez, J. M., L&#243;pez-Fern&#225;ndez, L. A., Climent, N., Gatell, J. M., Gallart, T., Esteban, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+gene+expression+profiling+after+infection+of+immature+human+monocyte-derived+dendritic+cells+by+the+attenuated+poxvirus+vectors+MVA+and+NYVAC.">Distinct gene expression profiling after infection of immature human monocyte-derived dendritic cells by the attenuated poxvirus vectors MVA and NYVAC.</a> 81 (16), 8707-8721 (2007).</li></ol>

Los pasos críticos Una segunda ronda de amplificación no se recomienda como sesgos en la matriz de datos se han observado. Mezclando con cuidado en cada paso enzimático (1 º y 2 º capítulo de síntesis de cDNA, IVT) es fundamental para obtener buenos rendimientos de amplificación, ya que es la incubación de cada paso enzimático a la temperatura adecuada. Un termociclador de PCR con tapa térmica ajustable se prefiere - incluso desviaciones tan pequeñas como 2-3 ...

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		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
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		<tbody>
		
<tr>
<td>Amino Allyl MessageAmp II aRNA amplification kit</td>
<td>Reagent</td>
<td>Applied Biosystems</td>
<td>AM1753</td>
<td>For 20 reactions</td>
</tr>
<tr>
<td>Amino Allyl MessageAmp II aRNA amplification kit</td>
<td>Reagent</td>
<td>Applied Biosystems</td>
<td>AM1821</td>
<td>For 100 reactions, in a 96-well format</td>
</tr>
<tr>
<td>NanoDrop ND-1000 UV-VIS spectrophotometer</td>
<td>Other</td>
<td>NanoDrop</td>
<td>ND-1000</td>
<td>Or equivalent spectrophotometer</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

vaccinia virus infection &amp; temporal analysis of virus gene expression: part 2

La familia<em&gt; Poxviridae</em&gt; Se compone de grandes de doble cadena de ADN que contienen los virus que se replican exclusivamente en el citoplasma de las células infectadas. Los miembros de la<em&gt; Orthopox</em&gt; Género incluyen la viruela, el agente causante de la viruela humana, viruela de los monos, y la vaccinia (VAC), el miembro prototípico de la familia del virus. En el genoma relativamente grande (~ 200 kb) vaccinia, tres clases de genes están codificados: temprana, intermedia y tardía. Mientras que las tres clases son transcritos por la forma viral codificada ARN polimerasas, cada clase tiene una función diferente en el ciclo de vida del virus. Poxvirus utilizar múltiples estrategias para la modulación del ambiente celular del huésped durante la infección. Con el fin de entender la regulación de host y la expresión de genes del virus, hemos utilizado todo el genoma enfoques para analizar la abundancia de transcripción de los dos virus y las células huésped. Aquí, demostramos las infecciones tiempo del curso de las células HeLa con virus de la vacuna y el ARN de muestreo en varios puntos temporales después de la infección. Tanto del huésped como del ARN viral total es aislado y amplificado por la hibridación de microarrays para el análisis de la expresión génica.

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Vaccinia Virus Infection & Temporal Analysis of Virus Gene Expression: Part 2

Protocolo de Vaccinia la infección de células HeLa y el análisis de la acogida y la expresión de genes virales.

Infección por el virus vaccinia y Análisis temporal de la expresión génica del virus: Parte 2

The family Poxviridae consists of large double-stranded DNA containing viruses that replicate exclusively in the cytoplasm of infected cells.  Members of ...

Research

JoVE Journal

Biology

Vaccinia Virus Infection &amp; Temporal Analysis of Virus Gene Expression: Part 2

Bacterial Gene Expression Analysis Using Microarrays

Gen bacteriano y Análisis de Expresión El uso de microarrays

Investigación

Biología

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

La preparación de cultivos primarios de células hematopoyéticas de la médula ósea murina por electroporación

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Vaccinia Virus Infection &amp; Temporal Analysis of Virus Gene Expression: Part 1

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Vaccinia Virus Infection &amp; Temporal Analysis of Virus Gene Expression: Part 3

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Infección por el virus vaccinia y Análisis temporal de la expresión génica del virus: Parte 3

Using the Gene Pulser MXcell Electroporation System to Transfect Primary Cells with High Efficiency

Utilizando el sistema de electroporación Gene Emisores MXcell para transfectar células primarias con alta eficiencia

Using an Automated Cell Counter to Simplify Gene Expression Studies: siRNA Knockdown of IL-4 Dependent Gene Expression in Namalwa Cells

El uso de un contador de células automatizado para simplificar estudios de expresión génica: siRNA Derribo de IL-4 la expresión génica en células dependientes Namalwa

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only ...

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

En la reconstitución in vitro de los activos T. castaneum telomerasa

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more ...

Agrobacterium-Mediated Virus-Induced Gene Silencing Assay In Cotton

Mediada por Agrobacterium inducida por el virus Gene ensayo silenciamiento en algodón

Cotton (Gossypium hirsutum) is one of the most important crops worldwide. Considerable efforts have been made on molecular breeding of new varieties.  The ...

Chemically-blocked Antibody Microarray for Multiplexed High-throughput Profiling of Specific Protein Glycosylation in Complex Samples

Anticuerpos, químicamente bloqueado Microarray de multiplexado de alto rendimiento de perfiles de glicosilación de proteínas específicas en muestras complejas

 In this study, we describe an effective protocol for use in a multiplexed high-throughput antibody microarray with glycan binding protein detection that ...

The MultiBac Protein Complex Production Platform at the EMBL

El Protein Complex Plataforma de Producción MultiBac en el EMBL

Proteomics  research revealed the impressive complexity of eukaryotic proteomes in  unprecedented detail. It is now a commonly accepted notion that ...