Name: a neuronal and astrocyte co-culture assay for high content analysis of neurotoxicity
Uploaded: 2009-05-05T00:00:00
Duration: 15 min 4 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Neuronal and Astrocyte Co-Culture Assay for High Content Analysis of Neurotoxicity at JoVE.com

فإن الكتاب أود أن أشكر الدكاترة. ريك ريان ، أوميش باتل ، وحتى جيف هسو ماثيو ، ميستري جيهانجير وميشيل Hatler للحصول على دعم خلال تطوير هذه المشاريع والبروتوكولات.

خلية التحضير : <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قبل البذر الخلية العصبية للمقايسة والثقافة ، و/ النجمية النمو في وسائل الإعلام حتى ~ متموجة 70-80 ٪ (ما لم تكن الخلية البذر مباشرة من الذوبان أو العزلة). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فصل الخلايا من قوارير ثقافة / لوحات عن طريق الأسلوب المناسب لنوع من الخلايا في المصالح. إذا لزم الأمر ، وحفر الآبار لوحة معطف مقايسة مع بروتين المصفوفة بولي - D - يسين أو خارج الخلية لتعزيز التصاق الخلية. قد يكون المصنف المشترك ثقافات النجمية والخلايا العصبية في نفس الوقت أو بالتتابع. تصنيف المنتخبات لمتسلسلة ، فمن المستحسن تصفيح النجمية أولا بوصفها طبقة &quot;القاعدية&quot; ، تليها الطلاء وتمايز الخلايا العصبية ، إذا لزم الأمر. ضبط كثافة الخلايا بما يتناسب مع نوع من الخلايا ، بعد وقت والثقافة ، والمعلمات في المصالح ، وما إلى ذلك اعتمادا على العمر والثقافة ، ومصدر الخلية وكثافة الغرس والثقافات الأولية قد تختلف اختلافا كبيرا في معدل الانتشار ، GFAP التعبير أو ثمرة neurite -- من المهم أن توصيف وتحسين النظام الخاص خلية لتوفير أكثر ملاءمة البيولوجية للنموذج التجريبي الخاص ، وكذلك لتوفير التصوير فعالة ، وتجزئة والتحليل باستخدام HCS (انظر الشكل 1). بعد إضافة الخلايا لوحة (قد تكون خلايا المصنف في 90 ميكرولتر وسائل الاعلام ، لتسهيل معالجة السم كما هو موضح في الخطوة 3 أدناه) ، والسماح لوحة على الجلوس على سطح مستو في درجة حرارة الغرفة ل15-30 دقيقة ، مما يتيح توزيع الخلية حتى. بعد هذه الفترة ، واحتضان خلايا النمو في وسائل الإعلام (37 ° / C 5 ٪ CO 2) ما لا يقل عن 24 ساعة ، ثم التبديل إلى ظروف ثقافة التمايز (على سبيل المثال ، المصل منخفض / NGF PC12 للخلايا) ، حسب الاقتضاء. تواصل الثقافة حتى تصل إلى مستوى الخلايا المطلوب من التقاء أو التمايز ، وتغيير وسائل الاعلام على فترات مناسبة لنوع من الخلايا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ويمكن إدخال علاجات الخلية (مركبات السيطرة ، اختبار المركبات ، الخ) في أي وقت خلال هذه الفترة والثقافة ، وبما يتناسب بالطبع وقت للعلاج من الفائدة. يتم توفير مادة الأكريلاميد ، بيروكسيد الهيدروجين وK - 252a ومركبات التحكم العصبي. يتم توفير الكواشف كافية لمكررة من 12 نقطة منحنيات الاستجابة للجرعة (بما في ذلك O 2 درهم أو مجموعة DMSO التحكم في الاستجابة للجرعة) لجميع لوحات five 96 - جيدا. يتم توفير هذه المركبات في تركيز 250X (K - 252a ل، على افتراض علاج أقصى 1 ميكرومتر) أو 10X (على مادة الأكريلاميد وبيروكسيد الهيدروجين ، على افتراض العلاجات أقصى 100 ملم و 10 ملم على التوالي). أوصى بإعداد العلاج ينطوي نصف السجل (1 : √ 10) التخفيف المتسلسل للمجمع في DMSO 250X ، تليها في تخفيف مؤقت لمجمع التخفيف 10X (يمكن السيطرة المركبات 10X منشؤها درهم 2 O المخفف متسلسل مباشرة في العقيمة O 2 درهم أو التخفيف مجمع العازلة). قد ثم 10 ميكرولتر من كل معاملة يمكن ان تضاف الى وسائل الاعلام ميكرولتر 90 من ثقافة موجودة بالفعل في كل بئر ، على التركيز إلى 1X النهائي (0.4 ٪ أو 10 ٪ DMSO درهم 2 O). يتم توفير نموذج البيانات لمدة 24 أو 96 ساعة من العلاج المركب عند 37 درجة مئوية قبل التثبيت. </li></ol> التثبيت الخلية ويلطخ مناعي : ملاحظة : الوقت هو تلطيخ ~ 2.5 ساعة بعد التثبيت. لا تسمح لتجف الآبار بين الخطوات تلطيخ. وينبغي إجراء الطموح والإعفاء من الكواشف في معدلات التدفق المنخفض لتقليل أي خسارة الخلايا نتيجة القص السوائل. وأوصت جميع &#39;لكل بئر&quot; الرجوع إلى مجلدات واحد جيد لmicroplate 96 - جيدا. وأوصت جميع &#39;في 96 - جيدا لوحة&quot; تشمل كميات الزائدة بنسبة 25 ٪ لمعالجة فقدان السوائل وحدة التخزين. يتم تنفيذ جميع الخطوات تلطيخ في درجة حرارة الغرفة (RT). جميع مخازن والحلول الضد مستقرة لمدة لا تقل عن 24 ساعة في RT. <ol start="4" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في نهاية الفترة والثقافة ، وقبل حلول الحارة التثبيت HCS (2X) إلى درجة حرارة الغرفة (RT) أو 37 درجة مئوية إذا كان المطلوب (12 mL/96-well لوحة). في غطاء الدخان الكيميائية ، إضافة 100 ميكرولتر / إضافة إلى وسائل الإعلام بشكل مباشر والثقافة ، وتسمح لإصلاح لمدة 30 دقيقة في RT. إزالة تثبيتي / توكسين التي تحتوي على وسائل الاعلام والتصرف فيها بما يتفق مع لوائح للنفايات الخطرة (أنظر MSDS). إذا كان الشروع فورا في تلطيخ ، وشطف كل بئر مرتين مع 200 ميكرولتر من الاحتياطي المناعي HCS. بدلا من ذلك ، إذا أن تكون لوحات ملطخة في وقت لاحق ، وشطف مرتين مع 200 ميكرولتر من الاحتياطي اغسل ، ثم ترك اشطفها ثانية وحدة التخزين في الآبار وألواح تخزين مغلقة بإحكام عند 4 درجات مئوية حتى تلطيخ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إذا تم تخزين عينات ثابتة عند 4 درجات مئوية قبل التلوين ، وشطف مرتين مع 200 مخزن HCS ميكرولتر المناعي قبل المضي قدما في بروتوكول تلطيخ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد العاملين حل المضادة للأرنب βIII تويولين / ماوس HCS أجسام المضادة للGFAP الابتدائية (6 mL/96-well وحة) على النحو التالي : إضافة 60 ميكرولتر من كل الأجسام المضادة الأولية لإذابة 5.88 مل من الاحتياطي المناعي HCS. مزيج جيد. إزالة الاحتياطي المناعي السابقة الشطف. إضافة 50 ميكرولتر من محلول جسم الابتدائية إلى كل بئر واحتضان لمدة 1 ساعة على RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة جسم الابتدائيةالحل. شطف ثلاث مرات مع 200 ميكرولتر الاحتياطي المناعي HCS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يعد حل عمل جسم HCS الثانوي / هويشت HCS النووية اللطخة (لوحة mL/96-well 6) على النحو التالي : إضافة 30 ميكرولتر من كل الأجسام المضادة الثانوية إذابة و 30 ميكرولتر من إذابة النووية HCS هويشت اللطخة إلى 5.91 مل من الاحتياطي المناعي HCS. مزيج جيد ، وحماية الحل بعيدا عن الضوء. إزالة السابقة الاحتياطي المناعي HCS الشطف. إضافة 50 ميكرولتر من جسم HCS الثانوي / هويشت HCS حل اللطخة النووية واحتضان لمدة 1 ساعة على RT ، محمية من الضوء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة HCS الثانوية جسم / هويشت HCS حل اللطخة النووية. شطف مرتين مع 200 ميكرولتر الاحتياطي المناعي HCS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة السابقة الاحتياطي المناعي HCS الشطف. شطف مرتين مع 200 ميكرولتر من الاحتياطي اغسل HCS ، تاركا اشطفها ثانية الحجم في الآبار. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ختم لوحة وصورة مباشرة ، أو متجر لوحة عند 4 درجات مئوية محمية من الضوء حتى جاهزة للتصوير. </li></ol> الحصول على الصور والتحليل : <ol start="12" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ويمكن تنفيذ التصوير والتحليل لوحات ملطخة على مجموعة متنوعة من المنصات HCS المتاحة ، بما في محلل الخلية (GE للرعاية الصحية) ، ArrayScan (ThermoFisher العلمية) أو الأوبرا (بيركن إلمر). وتقدم بعض المبادئ التوجيهية لالتصوير والتحليل في الجدول رقم 1 : </li></ol><table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td style="background:#000000; color:#FFFFFF;" colspan="4"> HCS222 المبادئ التوجيهية اقتناء صورة </td></tr><tr><td> كشف الكاشف </td><td> هدف لنس </td><td> متوسط ​​الإثارة تصفية [الذروة / عرض النطاق الترددي (نانومتر)] </td><td> تصفية متوسط ​​الانبعاثات [الذروة / عرض النطاق الترددي (نانومتر)] </td></tr><tr><td> هويشت HCS النووية اللطخة </td><td> 20X </td><td> 360/40 </td><td> 460/40 (535/50 أو إذا لزم الأمر) </td></tr><tr><td> HCS جسم الثانوي ، FITC - حمار المضادة للأرنب مفتش </td><td> 20X </td><td> 480/40 </td><td> 535/50 </td></tr><tr><td> HCS جسم الثانوي ، Cy3 - حمار المضادة للماوس مفتش </td><td> 20X </td><td> 535/50 </td><td> 600/50 </td></tr></tbody></table> <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td style="background:#000000; color:#FFFFFF;" colspan="4" width="545"> HCS222 إرشادات تحليل صورة </td></tr><tr><td> خلية معلمة </td><td> كشف </td><td> تجزئة / قياس </td><td> المنطق </td></tr><tr><td> عدد الخلايا ، الخصائص النووية </td><td> هويشت HCS النووية اللطخة </td><td> المنطقة النووية (460 قناة الانبعاثات نانومتر). عد عدد من النوى. محتوى الحمض النووي (كثافة النووية) ، أو التحليلات المجال النووي وممكن أيضا. </td><td> استخدام عدد الخلايا ، والخصائص النووية لتحديد الخسائر الخلية ، سمية الظواهر ، وما إلى ذلك يمكن &quot;تصفية&quot; نواة لتلك المرتبطة βIII - تويولين أو التعبير GFAP للحصول على عدد الخلايا العصبية منفصلة ونجمي / التوصيفات (يوصى بشدة). </td></tr><tr><td> βIII - تويولين ثمرة Neurite التعبير ، </td><td> HCS جسم الثانوي ، FITC - مترافق </td><td> هيولي المنطقة (535 نانومتر انبعاث القناة). ويمكن استخدام FITC إشارة إلى التمييز بين أجسام الخلايا العصبية من neurites (على سبيل المثال ، عن طريق الحد الأدنى / متوسط ​​المناطق خلايا الجسم ، وأطوال neurite الحد الأدنى / الأقصى وعرض). تحديد معايير مثل طول neurite إجمالي تعداد neurite / خلية ، الخ. </td><td> القياسات قد تكون ثمرة Neurite التضمين خلال تمايز الخلايا العصبية أو نتيجة الإصابة الكيميائية ، والحالات المرضية ، وما إلى ذلك يمكن &quot;تصفية&quot; الهيئات الخلية لتلك المرتبطة βIII تويولين التعبير ، للحصول على توصيف العصبية مميزة (يوصى بشدة). </td></tr><tr><td> GFAP التعبير ، منطقة نجمية </td><td> HCS جسم الثانوي ، Cy3 - مترافق </td><td> هيولي المنطقة (600 قناة الانبعاثات نانومتر). ويمكن استخدام Cy3 إشارة إلى تعريف تجزئة هيولي نجمي. تحديد بارامترات مثل متوسط ​​كثافة إشارة حشوية ، منطقة الخلية ، الخ. </td><td> GFAP التعبير ومنطقة نجمية الخلية قد تكون التضمين أثناء تطوير نجمية أو نتيجة الإصابة الكيميائية ، والحالات المرضية ، الخ &quot;تصفية&quot; الهيئات الخلية لتلك المرتبطة التعبير GFAP للحصول على توصيف نجمي مميزة (يوصى بشدة). </td></tr></tbody></table> . الجدول 1 صورة اقتناء وتحليل المبادئ التوجيهية -- HCS222 βIII-Tubulin/GFAP (المشارك للثقافة) الفحص ممثل النتائج : <img src="/files/ftp_upload/1173/figure31173.png" alt="الشكل 3" /> الشكل 1. βIII - تويولين وimmunofluore GFAPscence الثقافات الخلية العصبية الفئران مختلطة. وقد تم توليد المشترك ثقافات النجمية الفئران الحصين الابتدائية إما مع الخلايا العصبية الفئران أو الجرذان الأولية الحصين الخلايا PC12 ما قبل طلاء الخلايا النجمية لعدة أيام في الثقافة ، تليها بذر العصبية. وكانت الخلايا العصبية مثقف الأولية ل11 يوما إضافية ، بينما المثقف PC12s ليوم 2 إضافية في ظل ظروف التمايز (المصل منخفض / NGF). أجريت معالجة الخلايا ، وتثبيت immunostaining وفقا لبروتوكولات مقايسة HCS222. وكان تصوير الخلايا على شركة جنرال الكتريك في محلل خلية 1000 (3.3) في 20X (الخلايا العصبية الأولية) ، أو 10X التكبير الهدف (PC12) وتحليلها باستخدام GE في محطة خلية 1000 محلل (3.4) وثمرة Neurite موضوع خوارزميات تحليل لوحة الهدف الأعلى : صور تنصهر HCS هويشت مضان (الحمراء) النووية اللطخة (الأزرق) ، βIII - تويولين (الخضراء) وGFAP. تحليل منفصل للقناة مضان βIII - تويولين يسمح للتجزئة ثمرة neurite (لوحة الأوسط : أجسام الخلايا العصبية المحددة في (الزرقاء الأولية) ، أو الصفراء (PC12) ، neurites باللون الأخضر (الخلايا العصبية الأولية) ، أو الأزرق الفاتح (PC12)). تحليل للقناة GFAP يسمح للتجزئة نجمية (اللوحة السفلية : نوى المبينة باللون الأزرق ، السيتوبلازم باللون الأخضر). GFAP تجزئة للقرن آمون الفئران الخلايا العصبية الأولية / نجمية الثقافة المشتركة يدل على القدرة على التمييز بين النوى / خلية الهيئات التي GFAP (+) (الخطوط الخضراء) وتلك التي GFAP (--) (الحمراء) ، مما يمكن تعداد خلايا منفصلة الخلايا العصبية والخلايا النجمية في وضع ثقافة مختلطة. <img src="/files/ftp_upload/1173/figure41173.png" alt="الشكل 4" /> <img src="/files/ftp_upload/1173/figure4.51173.png" alt="figure4 part2" /> الشكل 2. الردود الأولية الفئران جرعة من الخلايا العصبية الحصين / نجمية المشترك الثقافات لتؤكد السامة. وكانت مطلية النجمية الجرذان الأولية الحصين (P6) على لوحات - 96 بشكل جيد في وسائط النمو والمثقف لمدة 6 أيام. وكانت المصنفة ثم الخلايا العصبية قرن آمون الفئران الأولية (المباشرة من ذوبان الجليد) على رأس قبل مطلي النجمية والمثقف في وسائل الإعلام النمو لمدة 11 يوما. تم علاج الخلايا مع التخفيفات المتسلسلة لبيروكسيد الهيدروجين أو الأكريلاميد (تركيزات بحد أقصى = و100mM 10MM ، على التوالي) عن ال 24 ساعة الماضية للثقافة. أجريت معالجة الخلايا ، وتثبيت immunostaining وفقا لبروتوكولات مقايسة HCS222. وكان تصوير الخلايا على شركة جنرال الكتريك في محلل خلية 1000 (3.3) في 20X (10 الحقول / جيد) وتحليلها (النووية / هيولي / neurite تجزئة) باستخدام GE في محطة خلية 1000 محلل (3.4) وثمرة Neurite موضوع خوارزميات تحليل الهدف. البيانات المقدمة ويعني ± SEM ، ن = 3. وقد تم التحقيق معلمات متعددة (ثمرة neurite ، وكثافة GFAP ، منطقة نجمية وعدد الخلايا العصبية أو نجمي) للجرعة التي تعتمد على الاتجاهات.

<ol>
	<li>Radio, N. M., Mundy, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+neurotoxicity+testing+in+vitro:+models+for+assessing+chemical+effects+on+neurite+outgrowth.">Developmental neurotoxicity testing in vitro: models for assessing chemical effects on neurite outgrowth.</a> Neurotoxicology. 29, 361-376 (2008).</li><li>Richards, G. R., Smith, A. J., Parry, F., Platts, A., Chan, G. K., Leveridge, M., Kerby, J. E., Simpson, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+morphology-+and+kinetics-based+cascade+for+human+neural+cell+high+content+screening.">A morphology- and kinetics-based cascade for human neural cell high content screening.</a> Assay Drug Dev Technol. 4, 143-152 (2006).</li><li>Evans, N. A., Facci, L., Owen, D. E., Soden, P. E., Burbidge, S. A., Prinjha, R. K., Richardson, J. C., Skaper, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abeta(1-42)+reduces+synapse+number+and+inhibits+neurite+outgrowth+in+primary+cortical+and+hippocampal+neurons:+A+quantitative+analysis.">Abeta(1-42) reduces synapse number and inhibits neurite outgrowth in primary cortical and hippocampal neurons: A quantitative analysis.</a> J Neurosci Methods. 175, 96-103 (2008).</li><li>Breier, J. M., Radio, N. M., Mundy, W. R., Shafer, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+high-throughput+screening+assay+for+chemical+effects+on+proliferation+and+viability+of+immortalized+human+neural+progenitor+cells.">Development of a high-throughput screening assay for chemical effects on proliferation and viability of immortalized human neural progenitor cells.</a> Toxicol Sci. 105, 119-133 (2008).</li><li>Radio, N. M., Breier, J. M., Shafer, T. J., Mundy, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+chemical+effects+on+neurite+outgrowth+in+PC12+cells+using+high+content+screening.">Assessment of chemical effects on neurite outgrowth in PC12 cells using high content screening.</a> Toxicol Sci. 105, 106-118 (2008).</li><li>Harry, G. J., Tiffany-Castiglioni, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+neurotoxic+potential+by+use+of+in+vitro+systems.">Evaluation of neurotoxic potential by use of in vitro systems.</a> Expert Opin Drug Metab Toxicol. 1, 701-713 (2005).</li><li>Prockop, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+allegory+of+a+mountain:+an+environmental+introduction+to+neurotoxicology.">The allegory of a mountain: an environmental introduction to neurotoxicology.</a> J Neurol Sci. 262, 7-14 (2007).</li><li>Woehrling, E. K., Hill, E. J., Coleman, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+neurotoxicity+test-system,+using+human+post-mitotic,+astrocytic+and+neuronal+cell+lines+in+co-culture.">Development of a neurotoxicity test-system, using human post-mitotic, astrocytic and neuronal cell lines in co-culture.</a> Toxicol In Vitro. 21, 1241-1246 (2007).</li><li>Holden, L. J., Coleman, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+the+astrogliotic+responses+of+three+human+astrocytoma+cell+lines+to+ethanol,+trimethyltin+chloride+and+acrylamide.">Assessment of the astrogliotic responses of three human astrocytoma cell lines to ethanol, trimethyltin chloride and acrylamide.</a> Toxicology. 241, 75-83 (2007).</li><li>R&#246;hl, C., Lucius, R., Sievers, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+activated+microglia+on+astrogliosis+parameters+in+astrocyte+cultures.">The effect of activated microglia on astrogliosis parameters in astrocyte cultures.</a> Brain Res. 1129, 43-52 (2007).</li><li>Eng, L. F., Ghirnikar, R. S., Lee, Y. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glial+fibrillary+acidic+protein:+GFAP-thirty-one+years+(1969-2000).">Glial fibrillary acidic protein: GFAP-thirty-one years (1969-2000).</a> Neurochem Res. 25, 1439-1451 (2000).</li><li>Gadea, A., Schinelli, S., Gallo, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelin-1+regulates+astrocyte+proliferation+and+reactive+gliosis+via+a+JNK/c-Jun+signaling+pathway.">Endothelin-1 regulates astrocyte proliferation and reactive gliosis via a JNK/c-Jun signaling pathway.</a> J Neurosci. 28, 2394-2408 (2008).</li><li>O'Callaghan, J. P., Sriram, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glial+fibrillary+acidic+protein+and+related+glial+proteins+as+biomarkers+of+neurotoxicity.">Glial fibrillary acidic protein and related glial proteins as biomarkers of neurotoxicity.</a> Expert Opin Drug Saf. 4, 433-442 (2005).</li><li>Mead, C., Pentreath, V. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+toxicity+indicators+in+rat+primary+astrocytes,+C6+glioma+and+human+1321N1+astrocytoma+cells:+can+gliotoxicity+be+distinguished+from+cytotoxicity?.">Evaluation of toxicity indicators in rat primary astrocytes, C6 glioma and human 1321N1 astrocytoma cells: can gliotoxicity be distinguished from cytotoxicity?.</a> Arch Toxicol. 72, 372-380 (1998).</li><li>Balls, M., Walum, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+11:+towards+the+acceptance+of+in+vitro+neurotoxicity+tests.">Chapter 11: towards the acceptance of in vitro neurotoxicity tests.</a> Neurotoxicology In Vitro. , 269-283 (1999).</li><li>Yokosuka, M., Ohtani-Kaneko, R., Yamashita, K., Muraoka, D., Kuroda, Y., Watanabe, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estrogen+and+environmental+estrogenic+chemicals+exert+developmental+effects+on+rat+hypothalamic+neurons+and+glias.">Estrogen and environmental estrogenic chemicals exert developmental effects on rat hypothalamic neurons and glias.</a> Toxicol In Vitro. 22, 1-9 (2008).</li><li>Weible, M. W., Chan-Ling, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+characterization+of+neural+stem+cells+from+human+fetal+spinal+cord:+synergistic+effect+of+LIF+and+BMP4+to+generate+astrocytes.">Phenotypic characterization of neural stem cells from human fetal spinal cord: synergistic effect of LIF and BMP4 to generate astrocytes.</a> Glia. 55, 1156-1168 (2007).</li><li>Casulari, L. A., Melcangi, R. C., Piva, F., Martini, L., Maggi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Factors+released+by+rat+type+1+astrocytes+exert+different+effects+on+the+proliferation+of+human+neuroblastoma+cells+(SH-SY5Y)+in+vitro.">Factors released by rat type 1 astrocytes exert different effects on the proliferation of human neuroblastoma cells (SH-SY5Y) in vitro.</a> Endocr Relat Cancer. 7, 63-71 (2000).</li><li>Dringen, R., Gutterer, J. M., Hirrlinger, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutathione+metabolism+in+brain+metabolic+interaction+between+astrocytes+and+neurons+in+the+defense+against+reactive+oxygen+species.">Glutathione metabolism in brain metabolic interaction between astrocytes and neurons in the defense against reactive oxygen species.</a> Eur J Biochem. 267, 4912-4916 (2000).</li><li>Crist&#242;fol, R. M., Gass&#243;, S., V&#237;lchez, D., Rodr&#237;guez-Farr&#233;, E., Sanfeliu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurotoxic+effects+of+trimethyltin+and+triethyltin+on+human+fetal+neuron+and+astrocyte+cultures:+a+comparative+study+with+rat+neuronal+cultures+and+human+cell+lines.">Neurotoxic effects of trimethyltin and triethyltin on human fetal neuron and astrocyte cultures: a comparative study with rat neuronal cultures and human cell lines.</a> Toxicol Lett. 152, 35-46 (2004).</li></ol>

الكتاب وجميع العاملين في المؤسسة ميليبور.

حتى الآن ، في التجارب المختبرية تهدف إلى دراسة وتقييم المخاطر العصبية باستخدام ثقافات مختلطة من الخلايا العصبية والخلايا النجمية كانت محدودة. فمن المعروف جيدا أن الخلايا الدبقية المقبولة هي جزء لا يتجزأ في تقديم الدعم المكاني والتمثيل الغذائي للخلايا العصبية ، وتلعب دورا حاسما في وظائف عدة تحوير الخلايا العصبية ، الخلايا العصبية بما في ذلك الهجرة ، والتمايز والنشاط متشابك. الخلايا النجمية الدبقية أيضا إطلاق سراح السيتوكينات وعوامل أخرى قابلة للذوبان والتي هي قادرة على التسامح على حد سواء العصبية تحفيز استجابات معاكسة في الأنسجة المحيطة العصبية ، فضلا عن تشجيع العديد من السموم. مما يدل على عمق التفاعلات العصبية - الدبقية ، وشارك في دراسات ثقافة ، وقد تبين أن الخلايا النجمية لحماية الخلايا العصبية ضد سمية الاكسدة ، في حين لم تظهر ضعف وظائف نجمي ، مثل الصيانة للدفاع المضادة للأكسدة ، ومستويات الطاقة الخلوية ، إلى تأثير حاسم بقاء الخلايا العصبية. وقد اقترحت الدراسات الحديثة أن استخدام الخلايا النجمية في اختبار النظام في المختبر العصبية قد تكون أكثر أهمية للإنسان هيكل الجهاز العصبي المركزي وظيفة من الخلايا العصبية وحدها. على الرغم من الوعي المتزايد لأهمية الفسيولوجية العصبية ، نجمي التفاعلات ، فقد كان في السابق من الصعب إجراء تحليل الكمي لهذه التفاعلات في خلايا سليمة. ظهور فحص نسبة عالية تمكن من تطوير فحوصات جديدة وقوية لمعالجة هذا الأمر. في هذه الدراسة ، وقد أثبتنا أن يتم إجراء تحليلات كمية من الظواهر المتعددة ونجمي الخلايا العصبية داخل مقايسة واحدة بفضل HCA. في الخلايا العصبية الأولية قد أجرينا القياسات الكمية من علامات العصبية مثل عدد الخلايا العصبية ، وطول العد neurite neurite. في الخلايا النجمية ، دباق رد الفعل هو معروف من العلامات البيولوجية العصبية ، التي تتميز التعديلات في التعبير GFAP ، وعدد نجمية ومورفولوجيا نجمية. لقد أثبتنا التي قد بسهولة كل من هذه النهاية أن تقيم عبر HCA. هذه الدراسات مفهوم الدعم التي يمكن أن تستخدم HCA من المؤشرات الحيوية العصبية محددة كجزء من مجموعة من التجارب في المختبر لفحص السريع لأعداد كبيرة من المواد الكيميائية بالنسبة لنهايات أعصاب. وتتألف لميليبور HCS222 تحليل محتوى عال عدة للثقافة مشتركة من الخلايا العصبية والخلايا النجمية من الكواشف ذات جودة عالية وبروتوكولات للالتنميط في وقت واحد ، βIII تويولين والدبقية ييفي البروتين الحمضية (GFAP) في طائفة واسعة من النماذج من العصبية الخلوية. الكواشف عالية التحقق المقدمة مع هذه المجموعة تسمح للمستخدم لتوحيد المقايسات ، والحد من مقايسة إلى مقايسة تقلباته ، وتوليد الصور بتكاثر مع نسبة إشارة إلى خلفية عالية.

<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Rabbit Anti-&#x03B2;III-Tubulin HCS Primary Antibody, 100X</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Part No. CS201672</td>
<td>1 vial containing 300 &micro;L 
Millipore HCS222 Kit Component</td>
</tr>
<tr>
<td>HCS Secondary Antibody (donkey anti-rabbit IgG, FITC conjugate), 200X</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Part No. CS201649</td>
<td>1 vial containing 150 &micro;L Millipore HCS222 Kit Component</td>
</tr>
<tr>
<td>Mouse Anti-GFAP HCS Primary Antibody, 100X</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Part No. CS201671</td>
<td>1 vial containing 300 &micro;L Millipore HCS222 Kit Component</td>
</tr>
<tr>
<td>HCS Secondary Antibody (donkey anti-mouse IgG, Cy3 conjugate), 200X</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Part No. CS200437</td>
<td>1 vial containing 150 &micro;L Millipore HCS222 Kit Component</td>
</tr>
<tr>
<td>Hoechst HCS Nuclear Stain, 200X</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Part No. CS200438</td>
<td>1 vial containing 150 &micro;L Millipore HCS222 Kit Component</td>
</tr>
<tr>
<td>HCS Fixation Solution with Phenol Red, 2X</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Part No. CS200434</td>
<td>1 bottle containing 100 mL Millipore HCS222 Kit Component</td>
</tr>
<tr>
<td>HCS Immunofluorescence Buffer, 1X</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Part No. CS200435</td>
<td>1 bottle containing 1000 mL Millipore HCS222 Kit Component</td>
</tr>
<tr>
<td>HCS Wash Buffer, 1X</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Part No. 2007643</td>
<td>1 bottle containing 500 mL Millipore HCS222 Kit Components</td>
</tr>
<tr>
<td>Acrylamide (Control Compound), 10X</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Part No. CS201679</td>
<td>1 vial containing 500 &micro;L of 1M acrylamide in dH2O Millipore HCS222 Kit Component</td>
</tr>
<tr>
<td>Hydrogen Peroxide (Control Compound), 10X</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Part No. CS201730</td>
<td>1 vial containing 500 &micro;L of 100 mM hydrogen peroxide in dH2O Millipore HCS222 Kit Components</td>
</tr>
<tr>
<td>K-252a (Control Compound), 250X</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Part No. CS201741</td>
<td>1 vial containing 100 &micro;L of 250 &micro;M K-252a in DMSO Millipore HCS222 Kit Component</td>
</tr>
<tr>
<td>DMSO for Compound Serial Dilution</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Part No. CS200441</td>
<td>1 bottle containing 10 mL Millipore HCS222 Kit Component</td>
</tr>
<tr>
<td>Compound Dilution Buffer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Part No. CS200442</td>
<td>1 bottle containing 25 mL Millipore HCS222 Kit Component</td>
</tr>
<tr>
<td>Plate Sealers</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Part No. CS200443</td>
<td>10 each Millipore HCS222 Kit Components</td>
</tr>
<tr>
<td>tissue culture-treated black/clear bottom microplates </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>HCS imaging/analysis system</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>

a neuronal and astrocyte co-culture assay for high content analysis of neurotoxicity

ارتفاع تحليل المحتوى (HCA) المقايسات دمج الخلايا والكواشف مع التصوير الآلي وقوية خوارزميات تحليل الصور ، مما يسمح بقياس الظواهر الخلوية متعددة ضمن مقايسة واحد. في هذه الدراسة ، استخدمت نحن HCA لوضع مقايسة رواية عن العصبية. العصبية التقييم يمثل جزءا هاما من تقييم سلامة العقاقير ، فضلا عن كونها والتركيز بشكل كبير من جهود حماية البيئة. بالإضافة إلى ذلك ، العصبية هي أيضا جيدة مقبولة<em&gt; في المختبر</em&gt; علامة لتطور الأمراض العصبية مثل مرض الزهايمر وأمراض الشلل الرعاش. مؤخرا ، تم الإبلاغ عن تطبيق HCA لفحص الخلايا العصبية. وذلك عبر تسمية الخلايا العصبية مع βIII - تويولين ، يمكن توفير فحوصات HCA الإنتاجية العالية ، وعدم الموضوعية ، والقياسات الكمية من المعلمات مثل عدد الخلايا العصبية ، والعد neurite neurite طول ، والتي يمكن أن تشير إلى التأثيرات السمية العصبية. ومع ذلك ، لا تزال غير مستكشفة دور الخلايا النجمية في هذه النماذج. النجمية يكون لها دور أساسي في الحفاظ على النظام العصبي المركزي (CNS) التوازن ، وترتبط مع كل من العصبية وneurodegradation عندما يتم تفجيرها في الاستجابة للمواد السامة أو الحالات المرضية. GFAP هو بروتين خيوط المتوسطة وأعرب في الغالب في الخلايا النجمية للجهاز العصبي المركزي. تفعيل نجمي (دباق) يؤدي إلى upregulation من GFAP ، يرافقه عادة من قبل الانتشار نجمية وتضخم. وقد اقترح هذه العملية من دباق رد الفعل باعتباره علامة مبكرة على حدوث ضرر للجهاز العصبي. الطريقة التقليدية لGFAP الكميات حسب المناعية. ويقتصر هذا النهج وعدم القدرة على توفير المعلومات عن التوطين الخلوية ، ومورفولوجيا وعدد الخلايا. مصممون التي يمكن استخدامها للتغلب على هذه HCA القيود ولقياس ميزات متعددة في وقت واحد المرتبطة دباق -- التغيرات في التعبير GFAP ، وتضخم نجمية ، وانتشار نجمية -- ضمن مقايسة واحد. في المشاركة في دراسات ثقافة ، وقد تبين أن الخلايا النجمية لحماية الخلايا العصبية ضد عدة أنواع من وسامة وإهانة خطيرة للتأثير على بقاء الخلايا العصبية. وقد اقترحت الدراسات الحديثة أن استخدام الخلايا النجمية في<em&gt; في المختبر</em&gt; قد تثبت نظام اختبار العصبية أكثر ملاءمة لبنية الإنسان وظيفة الجهاز العصبي المركزي من الخلايا العصبية وحدها. تبعا لذلك ، لدينا ضعت مقايسة HCA للثقافة مشتركة من الخلايا العصبية والخلايا النجمية ، التي تتألف من البروتوكولات والتحقق من صحتها والكواشف محددة الهدف الكشف عن التنميط βIII - تويولين الدبقية وبروتين لييفي الحمضية (GFAP). هذا الاختبار يمكن تحليل العصبية في وقت واحد ، neurite ثمرة ، دباق ، مورفولوجيا الخلايا العصبية والخلايا العصبية والتنمية نجمي ونجمي في طائفة واسعة من النماذج الخلوية ، وهو ما يمثل الرواية ، غير ذاتية ، والإنتاجية العالية مقايسة لتقييم العصبية. في مقايسة يحمل امكانات كبيرة للكشف عن العصبية تعزيز وتحسين الإنتاجية في مجال البحوث والأعصاب اكتشاف المخدرات.

Watch this Scientific Journal Video about A Neuronal and Astrocyte Co-Culture Assay for High Content Analysis of Neurotoxicity at JoVE.com

A Neuronal and Astrocyte Co-Culture Assay for High Content Analysis of Neurotoxicity

توضح هذه المقالة بروتوكول الرواية وكاشف مجموعة مصممة لقياس التأثيرات السمية العصبية الحساسة للمركبات والعلاجات على الثقافات المشتركة من الخلايا العصبية والخلايا النجمية باستخدام عالية تحليل المحتوى. تظهر النتائج ان ارتفاع تحليل المضمون يمثل تكنولوجيا جديدة مثيرة لتقييم العصبية.

والخلايا العصبية ونجمية المشارك الثقافة الفحص لتحليل محتوى عال من العصبية

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing ...

Research

JoVE Journal

Biology

Neuronal Cell Cultures from Aplysia for High-Resolution Imaging of Growth Cones

الخلية العصبية من الثقافات Aplysia عن التصوير عالية الدقة من المخاريط النمو

Neuronal growth cones are the highly motile structures at the tip of axons that can detect guidance cues in the environment and transduce this information ...

A Multi-compartment CNS Neuron-glia Co-culture Microfluidic Platform

حجرة متعددة الخلية العصبية الجهاز العصبي المركزي ، الدبقية منهاج ميكروفلويديك المشارك الثقافة

We present a novel multi-compartment neuron co-culture microsystem platform for in vitro CNS axon-glia interaction research, capable of conducting up to ...

Microfluidic Co-culture of Epithelial Cells and Bacteria for Investigating Soluble Signal-mediated Interactions

ميكروفلويديك المشارك ثقافة الخلايا الظهارية والبكتيريا للتحقيق في ذوبان الإشارات بوساطة التفاعلات

The human gastrointestinal (GI) tract is a unique environment in which intestinal epithelial cells and non-pathogenic (commensal) bacteria coexist. It has ...

Analysis of Schwann-astrocyte Interactions Using In Vitro Assays

Analysis of Schwann-astrocyte Interactions Using In Vitro Assays

تحليل شفان نجمية طريق التفاعلات في المختبر فحوصات

Schwann cells are one of the commonly used cells in repair strategies following spinal cord injuries. Schwann cells are capable of supporting axonal ...

Quantification of dsDNA using the Hitachi F-7000 Fluorescence Spectrophotometer and PicoGreen Dye

الكمي للdsDNA باستخدام F - 7000 هيتاشي الإسفار الطيف وصبغ PicoGreen

Quantification of DNA, especially in small concentrations, is an important task with a wide range of biological applications including standard molecular ...

Absolute Quantum Yield Measurement of Powder Samples

مطلق قياس العائد الكم من عينات مسحوق

Measurement of fluorescence quantum yield has become an important tool in the search for new solutions in the development, evaluation, quality control and ...

A High-content Imaging Workflow to Study Grb2 Signaling Complexes by Expression Cloning

سير عمل التصوير عالي المحتوى لدراسة Grb2 مجمعات اشارة عن طريق الاستنساخ التعبير

Signal  transduction by growth factor receptors is essential for cells to maintain  proliferation and differentiation and requires tight control. Signal  ...

A High Throughput MHC II Binding Assay for Quantitative Analysis of Peptide Epitopes

A تجليد الفحص إنتاجية عالية MHC II لتحليل الكمي لالببتيد الحواتم

Biochemical assays with recombinant human MHC II molecules can provide rapid, quantitative insights into immunogenic epitope identification, deletion, or ...

qPCRTag Analysis - A High Throughput, Real Time PCR Assay for Sc2.0 Genotyping

تحليل qPCRTag - إنتاجية عالية، في الوقت الحقيقي PCR الفحص لSc2.0 التنميط الجيني

The Synthetic Yeast Genome Project (Sc2.0) aims to build 16 designer yeast chromosomes and combine them into a single yeast cell. To date one synthetic ...

High Content Screening Analysis to Evaluate the Toxicological Effects of Harmful and Potentially Harmful Constituents (HPHC)

High Content Screening Analysis to Evaluate the Toxicological Effects of Harmful and Potentially Harmful Constituents HPHC

عالية تحليل فحص المحتوى لتقييم الآثار السمية للمكونات الضارة والمؤذية يحتمل (HPHC)

Cigarette smoke (CS) is a major risk factor for cardiovascular and lung diseases. Because CS is a complex aerosol containing more than 7,000 chemicals1 it ...