Name: a neuronal and astrocyte co-culture assay for high content analysis of neurotoxicity
Uploaded: 2009-05-05T00:00:00
Duration: 15 min 4 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Neuronal and Astrocyte Co-Culture Assay for High Content Analysis of Neurotoxicity at JoVE.com

המחברים מבקשים להודות בני הזוג. ריק ריאן, ואומש פאטל, ג&#39;ף עד, מתיו הסו, ג&#39;האנגיר מיסטרי ומישל Hatler על התמיכה במהלך הפיתוח של הפרויקטים הללו ופרוטוקולים.

תא הכנה: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני זריעת התא, assay תרבות נוירונים / האסטרוציטים בתקשורת צמיחה עד ~ ומחוברות 70-80% (אלא אם כן תא זריעת ישירות ההפשרה או בידוד). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ניתוק תאים צלוחיות תרבות / צלחות דרך בשיטה המתאימה לסוג התא של עניין. אם יש צורך, assay מעיל בארות צלחת עם חלבון פולי-D-ליזין או תאיים מטריקס לשפר את הידבקות התא. Co-התרבויות של האסטרוציטים ונוירונים ניתן seeded בו זמנית או ברצף. עבור seedings רציפים, ציפוי של האסטרוציטים הראשונה שכבה &quot;הבסיס&quot; מומלץ, ואחריו ציפוי בידול העצבית, ובמידת הצורך. התאם את צפיפות התאים בהתאם לסוג התא, תרבות זמן לאחר מכן, פרמטרים של עניין, וכו &#39;בהתאם לגיל, תרבות, מקור התא צפיפות זריעה, תרבויות העיקרי עשויים להשתנות במידה ניכרת בשיעור של שגשוג, הביטוי GFAP או תולדה neurite - חשוב לאפיין לייעל את המערכת הסלולרי שלך כדי לספק את הרלוונטיות ביותר עבור מודל הביולוגי הניסיוני שלך, כמו גם לספק הדמיה פילוח יעיל, ניתוח באמצעות HCS (ראה איור 1). לאחר הוספת תאים לצלחת (תאים עשויים להיות seeded ב 90 μL התקשורת, כדי להקל על הטיפול רעלן כמתואר שלב 3 להלן), מאפשרים צלחת לשבת על משטח ישר בטמפרטורת החדר למשך 15-30 דקות, מה שמאפשר הפצה תא אפילו. לאחר תקופה זו, תאים דגירה בתקשורת צמיחה (37 ° C / 5% CO 2) לפחות 24 שעות, ולאחר מכן לעבור בתנאים תרבות בידול (לדוגמה, בסרום נמוך / NGF עבור PC12 תאים), בהתאם. המשך התרבות תאים להגיע עד הרמה הרצויה של מפגש או בידול, שינוי התקשורת במרווחים המתאימה לסוג התא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טיפולים נייד (תרכובות שליטה, תרכובות מבחן, וכו &#39;) יכול להיות מוצג בכל נקודה במהלך תקופה זו תרבות, בהתאם כמובן בזמן הטיפול של עניין. Acrylamide, מי חמצן ו - K-252a מסופקים תרכובות לשלוט neurotoxic. ריאגנטים מספיק ניתנים לשכפל 12 נקודות בתגובה עקומות מנה (כולל DH 2 O או DMSO שליטה מוגדר בתוך בתגובה את המינון) עבור כל חמש צלחות 96-היטב. תרכובות ניתנים בריכוז 250X (עבור K-252a, בהנחה טיפול מרבי של 1 מיקרומטר) או 10X (עבור acrylamide ואת מי חמצן, בהנחה טיפולים המרבי של 100 mM ו - 10 מ&quot;מ, בהתאמה). הכנה הטיפול המומלץ כולל חצי log (1: √ 10) דילול סדרתי של המתחם 250X ב DMSO, ואחריה דילול של הצפת דילול מתחם ל 10X (תרכובות לשלוט 10X שמקורם DH 2 O יכול להיות מדולל סדרתי ישירות סטרילי DH 2 O או דילול מאגר מתחם). 10 μL של כל טיפול עשוי מכן יתווספו 90 μL של התקשורת בתרבות הנוכחית כבר כל טוב, כי ריכוז 1X האחרון (0.4% או 10% DMSO DH 2 O). נתונים לדוגמה מסופק 24 או 96 שעות של טיפול במתחם ב 37 ° C לפני קיבעון. </li></ol> קיבוע נייד ו מכתים Immunofluorescent: הערה: הזמן הוא מכתים ~ 2.5 שעות שלאחר קיבעון. אל תאפשר בארות להתייבש בין הצעדים מכתים. שאיפה של חומרים כימיים ואת היתר צריכה להתנהל ברמות ספיקה נמוכה כדי לצמצם אובדן התא עקב גזירה נוזל. כל המומלצים &quot;לכל טוב&quot; כרכים מתייחסים אחד טוב של microplate 96-היטב. כל המומלצים &quot;לכל 96-היטב צלחת &#39;כרכים כוללים עודף של 25% על אובדן טיפול הנוזל נפח. כל הצעדים מכתים מבוצעות בטמפרטורת החדר (RT). כל מאגרי פתרונות נוגדנים הם יציבים במשך לפחות 24 שעות RT. <ol start="4" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בסוף תקופת תרבות, טרום חם פתרון HCS קיבוע (2X) לטמפרטורת החדר (RT) או 37 מעלות צלזיוס אם רוצים (12 צלחת mL/96-well). במנדף כימי קטר, להוסיף 100 μL / גם ישירות למדיה תרבות ולאפשר לתקן למשך 30 דקות ב RT. הסר מקבע / רעלן המכיל מדיה להיפטר בקנה אחד עם תקנות פסולת מסוכנת (ראה MSDS). אם הליך מיד מכתים, לשטוף היטב פעמיים עם כל μL 200 של הצפת immunofluorescence HCS. לחילופין, אם יש צלחות מוכתמות במועד מאוחר יותר, לשטוף פעמיים עם μL 200 של הצפת לשטוף, אז לעזוב הכרך השני לשטוף בבארות וצלחות החנות סגורה היטב ב-C º 4 עד מכתים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם דגימות קבוע אוחסנו ב-C º 4 לפני מכתים, לשטוף פעמיים עם הצפת 200 HCS μL immunofluorescence לפני שתמשיך פרוטוקול מכתים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן עובד הפתרון של הארנב נגד βIII טובולין / עכבר נגד GFAP נוגדנים HCS ראשיים (6 צלחת mL/96-well) כדלקמן: הוסף 60 μL של כל נוגדן ראשוני מופשר ל 5.88 מ&quot;ל של הצפת immunofluorescence HCS. מערבבים היטב. הסר חוצץ immunofluorescence הקודם לשטוף. הוסף 50 μL של פתרון נוגדן ראשוני זה היטב דגירה במשך שעה 1 ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר נוגדן ראשוניהפתרון. לשטוף שלוש פעמים עם 200 הצפת μL immunofluorescence HCS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון עבודה של נוגדן HCS משני / Hoechst HCS גרעיני כתמים (6 צלחת mL/96-well) כדלקמן: הוסף 30 μL של נוגדן זה משני מופשר 30 μL של מופשר Hoechst HCS גרעיני כתמים על 5.91 מ&quot;ל של הצפת immunofluorescence HCS. מערבבים היטב, פתרון הגנה מן האור. הסר חוצץ הקודם HCS immunofluorescence לשטוף. הוסף 50 μL של נוגדן HCS משני / Hoechst פתרון HCS כתמים גרעיני דגירה במשך שעה 1 ב RT, מוגן מפני אור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר HCS פתרון יסודי נוגדן / Hoechst HCS כתמים גרעיני. שטפו פעמיים עם 200 הצפת μL immunofluorescence HCS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר חוצץ הקודם HCS immunofluorescence לשטוף. שטפו פעמיים עם μL 200 של הצפת לשטוף HCS, עוזב הכרך השני לשטוף בבארות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צלחת חותם התמונה מיד, או לאחסן צלחת ב-C º 4 מוגנת מפני אור עד מוכן הדמיה. </li></ol> תמונה רכישה ניתוח: <ol start="12" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הדמיה וניתוח של צלחות מוכתמות ניתן לבצע על מגוון רחב של פלטפורמות HCS זמין, כולל IN Analyzer Cell (GE Healthcare), ArrayScan (ThermoFisher מדעי) או אופרה (פרקין אלמר). הנחיות מסוימות הדמיה וניתוח ניתנים טבלה 1: </li></ol><table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td style="background:#000000; color:#FFFFFF;" colspan="4"> HCS222 רכישת תמונה הנחיות </td></tr><tr><td> איתור מגיב </td><td> המטרה עדשה </td><td> טווח עירור סנן [שיא / רוחב פס (ננומטר)] </td><td> טווח פליטה סנן [שיא / רוחב פס (ננומטר)] </td></tr><tr><td> Hoechst HCS גרעיני כתמים </td><td> 20X </td><td> 360/40 </td><td> 460/40 (535/50 או אם יש צורך) </td></tr><tr><td> HCS נוגדן משניים, FITC-חמור נגד ארנב IgG </td><td> 20X </td><td> 480/40 </td><td> 535/50 </td></tr><tr><td> HCS נוגדן משניים, Cy3-Donkey אנטי עכבר IgG </td><td> 20X </td><td> 535/50 </td><td> 600/50 </td></tr></tbody></table> <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td style="background:#000000; color:#FFFFFF;" colspan="4" width="545"> HCS222 ניתוח תמונה הנחיות </td></tr><tr><td> תא פרמטר </td><td> איתור </td><td> פילוח / מדידה </td><td> רציונל </td></tr><tr><td> מספר סלולרי, מאפייני גרעיני </td><td> Hoechst HCS גרעיני כתמים </td><td> האזור גרעיני (460 פליטה ערוץ ננומטר). ספירת מספר גרעינים. תוכן ה-DNA (בעוצמה גרעינית) או ניתוחים באזור גרעיני גם אפשרי. </td><td> שימוש במספר התא, המאפיינים גרעיני כדי לקבוע הפסד התא, פנוטיפים רעילות וכו &#39;ניתן &quot;לסנן&quot; גרעינים אלו הקשורים טובולין-βIII או ביטוי GFAP להשיג נפרד ספירת תא עצב astrocytic / אפיונים (מומלץ בחום). </td></tr><tr><td> βIII-טובולין, הביטוי Neurite תולדה </td><td> HCS נוגדן משניים, FITC-מצומדות </td><td> אזור cytoplasmic (535 ננומטר פליטת ערוץ). אות FITC ניתן להשתמש כדי להבחין גופי התא של הנוירונים neurites (למשל, באמצעות מינימום / ממוצע הגוף באזורים התא, אורך neurite מינימום / מקסימום רוחב). קביעת פרמטרים כגון אורך neurite מוחלט, שקובע neurite / סלולריים, ועוד </td><td> מדידות Neurite תוצאה עשויה להיות מווסתת במהלך התמיינות נוירונים או כתוצאה מפגיעה כימית, מדינות מחלה וכו &#39;יכול &quot;לסנן&quot; גופי התא של אלה הקשורים ביטוי βIII-טובולין לקבל אפיון עצביים שונים (מומלץ מאוד). </td></tr><tr><td> הביטוי GFAP, שטח Astrocyte </td><td> HCS נוגדן משניים, Cy3-מצומדות </td><td> אזור cytoplasmic (600 פליטה ערוץ ננומטר). אות Cy3 ניתן להשתמש כדי להגדיר פילוח cytoplasmic astrocytic. קביעת פרמטרים כגון עוצמת האות הממוצע cytoplasmic, אזור תא, וכו &#39; </td><td> הביטוי GFAP באזור תא astrocyte יכול להיות מאופנן במהלך הפיתוח astrocyte או כתוצאה מפגיעה כימית, מדינות מחלה וכו &#39;יכול &quot;לסנן&quot; גופי התא של אלה הקשורים ביטוי GFAP לקבל אפיון astrocytic ברורים (מומלץ בחום). </td></tr></tbody></table> . טבלה 1 תמונה רכישה ניתוח הנחיות - HCS222 βIII-Tubulin/GFAP (Co-תרבות) Assay נציג תוצאות: <img src="/files/ftp_upload/1173/figure31173.png" alt="איור 3" /> באיור 1. βIII-טובולין ו GFAP immunofluorescence מעורבת של תרבויות עכברוש עצביים התא. Co-התרבויות של האסטרוציטים עכברוש העיקרי בהיפוקמפוס עם או נוירונים בהיפוקמפוס עכברוש העיקרי או PC12 תאים עכברוש נוצרו על ידי ציפוי מראש האסטרוציטים במשך כמה ימים בתרבות, ואחריו זריעת עצביים. נוירונים בתרבית ראשונית היו עבור 11 ימים נוספים, תוך PC12s היו בתרבית עבור 2 ימים נוספים בתנאי בידול (בסרום נמוך / NGF). טיפול Cell, קיבעון ו immunostaining בוצעו על פי פרוטוקולים HCS222 assay. תאים הם צילמו על GE בתא Analyzer 1000 (3.3) בשעה 20X (נוירונים העיקרי) או הגדלה 10X (PC12) המטרה ונותחו באמצעות GE תחנת עבודה נייד 1000 Analyzer (3.4) תוצאה Neurite ו Multi ניתוח אלגוריתמים יעד הפאנל למעלה.: תמונות התמזגו של הקרינה Hoechst HCS (אדום) גרעיני כתמים (כחול), βIII-טובולין (ירוק) ו GFAP. ניתוח נפרד של ערוץ βIII-טובולין את הקרינה מאפשר פילוח תולדה neurite (באמצע הפאנל: גופי התא המתוארים (נוירונים כחול העיקרי) או צהוב (PC12), neurites בירוק (נוירונים ראשונית) או תכלת (PC12)). ניתוח של ערוץ GFAP מאפשר פילוח astrocyte (פאנל התחתונה: גרעינים המתוארים כחול, הציטופלסמה בירוק). פילוח GFAP של עכברוש הראשוני בהיפוקמפוס תרבות שיתוף נוירון / astrocyte מדגים את היכולת להבחין בין גרעינים / תא הגופים כי הם GFAP (+) (ירוק מתאר) לבין אלה GFAP (-) (אדום), המאפשר ספירת תאים נפרדים נוירונים האסטרוציטים בסביבה תרבות מעורבת. <img src="/files/ftp_upload/1173/figure41173.png" alt="איור 4" /> <img src="/files/ftp_upload/1173/figure4.51173.png" alt="figure4 part2" /> איור 2. תגובות מנה של עכברוש הראשוני בהיפוקמפוס נוירון / astrocyte שיתוף תרבויות מדגיש רעילים. האסטרוציטים עכברוש ראשי בהיפוקמפוס (P6) היו מצופה על 96-היטב צלחות בתקשורת צמיחה בתרבית למשך 6 ימים. נוירונים בהיפוקמפוס עכברוש ראשיים (ישיר להפשיר) היו זורעים אז על גבי טרום מצופה האסטרוציטים ותרבותיים בתקשורת צמיחה במשך 11 ימים. תאים שטופלו דילולים הסידורי של חמצן acrylamide או מימן (ריכוז מרבי = 100mm ו - 10mm, בהתאמה) במשך 24 השעות האחרונות של התרבות. טיפול Cell, קיבעון ו immunostaining בוצעו על פי פרוטוקולים HCS222 assay. תאים הם צילמו על GE בתא Analyzer 1000 (3.3) בשעה 20X (10 שדות / טוב) ונותחו (גרעיני / cytoplasmic / neurite פילוח) באמצעות GE תחנת עבודה נייד 1000 Analyzer (3.4) תוצאה Neurite ו Multi ניתוח אלגוריתמים יעד. הנתונים המוצגים הינם ממוצע ± SEM, n = 3. פרמטרים מרובים (תוצאה neurite, עוצמת GFAP, אזור astrocyte וספירת תאים עצביים או astrocytic) נחקרו על המינון תלוי במגמות.

<ol>
	<li>Radio, N. M., Mundy, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+neurotoxicity+testing+in+vitro:+models+for+assessing+chemical+effects+on+neurite+outgrowth.">Developmental neurotoxicity testing in vitro: models for assessing chemical effects on neurite outgrowth.</a> Neurotoxicology. 29, 361-376 (2008).</li><li>Richards, G. R., Smith, A. J., Parry, F., Platts, A., Chan, G. K., Leveridge, M., Kerby, J. E., Simpson, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+morphology-+and+kinetics-based+cascade+for+human+neural+cell+high+content+screening.">A morphology- and kinetics-based cascade for human neural cell high content screening.</a> Assay Drug Dev Technol. 4, 143-152 (2006).</li><li>Evans, N. A., Facci, L., Owen, D. E., Soden, P. E., Burbidge, S. A., Prinjha, R. K., Richardson, J. C., Skaper, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abeta(1-42)+reduces+synapse+number+and+inhibits+neurite+outgrowth+in+primary+cortical+and+hippocampal+neurons:+A+quantitative+analysis.">Abeta(1-42) reduces synapse number and inhibits neurite outgrowth in primary cortical and hippocampal neurons: A quantitative analysis.</a> J Neurosci Methods. 175, 96-103 (2008).</li><li>Breier, J. M., Radio, N. M., Mundy, W. R., Shafer, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+high-throughput+screening+assay+for+chemical+effects+on+proliferation+and+viability+of+immortalized+human+neural+progenitor+cells.">Development of a high-throughput screening assay for chemical effects on proliferation and viability of immortalized human neural progenitor cells.</a> Toxicol Sci. 105, 119-133 (2008).</li><li>Radio, N. M., Breier, J. M., Shafer, T. J., Mundy, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+chemical+effects+on+neurite+outgrowth+in+PC12+cells+using+high+content+screening.">Assessment of chemical effects on neurite outgrowth in PC12 cells using high content screening.</a> Toxicol Sci. 105, 106-118 (2008).</li><li>Harry, G. J., Tiffany-Castiglioni, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+neurotoxic+potential+by+use+of+in+vitro+systems.">Evaluation of neurotoxic potential by use of in vitro systems.</a> Expert Opin Drug Metab Toxicol. 1, 701-713 (2005).</li><li>Prockop, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+allegory+of+a+mountain:+an+environmental+introduction+to+neurotoxicology.">The allegory of a mountain: an environmental introduction to neurotoxicology.</a> J Neurol Sci. 262, 7-14 (2007).</li><li>Woehrling, E. K., Hill, E. J., Coleman, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+neurotoxicity+test-system,+using+human+post-mitotic,+astrocytic+and+neuronal+cell+lines+in+co-culture.">Development of a neurotoxicity test-system, using human post-mitotic, astrocytic and neuronal cell lines in co-culture.</a> Toxicol In Vitro. 21, 1241-1246 (2007).</li><li>Holden, L. J., Coleman, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+the+astrogliotic+responses+of+three+human+astrocytoma+cell+lines+to+ethanol,+trimethyltin+chloride+and+acrylamide.">Assessment of the astrogliotic responses of three human astrocytoma cell lines to ethanol, trimethyltin chloride and acrylamide.</a> Toxicology. 241, 75-83 (2007).</li><li>R&#246;hl, C., Lucius, R., Sievers, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+activated+microglia+on+astrogliosis+parameters+in+astrocyte+cultures.">The effect of activated microglia on astrogliosis parameters in astrocyte cultures.</a> Brain Res. 1129, 43-52 (2007).</li><li>Eng, L. F., Ghirnikar, R. S., Lee, Y. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glial+fibrillary+acidic+protein:+GFAP-thirty-one+years+(1969-2000).">Glial fibrillary acidic protein: GFAP-thirty-one years (1969-2000).</a> Neurochem Res. 25, 1439-1451 (2000).</li><li>Gadea, A., Schinelli, S., Gallo, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelin-1+regulates+astrocyte+proliferation+and+reactive+gliosis+via+a+JNK/c-Jun+signaling+pathway.">Endothelin-1 regulates astrocyte proliferation and reactive gliosis via a JNK/c-Jun signaling pathway.</a> J Neurosci. 28, 2394-2408 (2008).</li><li>O'Callaghan, J. P., Sriram, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glial+fibrillary+acidic+protein+and+related+glial+proteins+as+biomarkers+of+neurotoxicity.">Glial fibrillary acidic protein and related glial proteins as biomarkers of neurotoxicity.</a> Expert Opin Drug Saf. 4, 433-442 (2005).</li><li>Mead, C., Pentreath, V. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+toxicity+indicators+in+rat+primary+astrocytes,+C6+glioma+and+human+1321N1+astrocytoma+cells:+can+gliotoxicity+be+distinguished+from+cytotoxicity?.">Evaluation of toxicity indicators in rat primary astrocytes, C6 glioma and human 1321N1 astrocytoma cells: can gliotoxicity be distinguished from cytotoxicity?.</a> Arch Toxicol. 72, 372-380 (1998).</li><li>Balls, M., Walum, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+11:+towards+the+acceptance+of+in+vitro+neurotoxicity+tests.">Chapter 11: towards the acceptance of in vitro neurotoxicity tests.</a> Neurotoxicology In Vitro. , 269-283 (1999).</li><li>Yokosuka, M., Ohtani-Kaneko, R., Yamashita, K., Muraoka, D., Kuroda, Y., Watanabe, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estrogen+and+environmental+estrogenic+chemicals+exert+developmental+effects+on+rat+hypothalamic+neurons+and+glias.">Estrogen and environmental estrogenic chemicals exert developmental effects on rat hypothalamic neurons and glias.</a> Toxicol In Vitro. 22, 1-9 (2008).</li><li>Weible, M. W., Chan-Ling, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+characterization+of+neural+stem+cells+from+human+fetal+spinal+cord:+synergistic+effect+of+LIF+and+BMP4+to+generate+astrocytes.">Phenotypic characterization of neural stem cells from human fetal spinal cord: synergistic effect of LIF and BMP4 to generate astrocytes.</a> Glia. 55, 1156-1168 (2007).</li><li>Casulari, L. A., Melcangi, R. C., Piva, F., Martini, L., Maggi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Factors+released+by+rat+type+1+astrocytes+exert+different+effects+on+the+proliferation+of+human+neuroblastoma+cells+(SH-SY5Y)+in+vitro.">Factors released by rat type 1 astrocytes exert different effects on the proliferation of human neuroblastoma cells (SH-SY5Y) in vitro.</a> Endocr Relat Cancer. 7, 63-71 (2000).</li><li>Dringen, R., Gutterer, J. M., Hirrlinger, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutathione+metabolism+in+brain+metabolic+interaction+between+astrocytes+and+neurons+in+the+defense+against+reactive+oxygen+species.">Glutathione metabolism in brain metabolic interaction between astrocytes and neurons in the defense against reactive oxygen species.</a> Eur J Biochem. 267, 4912-4916 (2000).</li><li>Crist&#242;fol, R. M., Gass&#243;, S., V&#237;lchez, D., Rodr&#237;guez-Farr&#233;, E., Sanfeliu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurotoxic+effects+of+trimethyltin+and+triethyltin+on+human+fetal+neuron+and+astrocyte+cultures:+a+comparative+study+with+rat+neuronal+cultures+and+human+cell+lines.">Neurotoxic effects of trimethyltin and triethyltin on human fetal neuron and astrocyte cultures: a comparative study with rat neuronal cultures and human cell lines.</a> Toxicol Lett. 152, 35-46 (2004).</li></ol>

המחברים הם כל העובדים של Millipore Corporation.

עד כה, בניסויים במבחנה נועד המחקר הסיכון neurotoxicity הערכה באמצעות תרביות מעורבות של נוירונים האסטרוציטים היה מוגבל. זה היטב מקובל כי תאי גלייה הם חלק בלתי נפרד במתן תמיכה מרחבית מטבולית לנוירונים, לשחק תפקיד קריטי ויסות עצבי פונקציות שונות, כולל הגירה בידול עצבית, פעילות סינפטית. האסטרוציטים גליה גם לשחרר ציטוקינים וגורמים מסיסים אחרים המסוגלים סובלנות הן עצבי וגורם לתגובות שליליות לרקמות העצבית, כמו גם קידום של רעלים רבים. הדגמת העומק של נוירונים, גליה אינטראקציות, ב שיתוף תרבות מחקרים, האסטרוציטים הוכחו כדי להגן על הנוירונים מפני רעילות של סטרס חמצוני, ואילו ליקוי astrocytic של פונקציות, כגון החזקת ההגנה נוגדת החמצון ורמות האנרגיה התאית, הוכח השפעה קריטית להישרדות עצביים. מחקרים שנעשו לאחרונה הראו כי השימוש האסטרוציטים ב במערכת בדיקה חוץ גופית neurotoxicity עשוי להוכיח רלוונטיות יותר במבנה מערכת העצבים המרכזית האדם ותפקודו מאשר תאים עצביים לבד. למרות המודעות ההולכת וגדלה של המשמעות הפיזיולוגית של הנוירונים-astrocytic אינטראקציות, זה כבר קודם לכן קשה לבצע ניתוחים כמותיים של אינטראקציות אלה בתאים שלמים. הופעתו של הקרנת תכנים גבוהה מאפשרת את הפיתוח של מבחני חדש רב עוצמה לכתובת זו. במחקר זה, אנו הראו כי ניתוחים כמותיים של פנוטיפים עצב astrocytic מרובים בתוך assay יחיד מתאפשרים הודות HCA. בנוירונים העיקרי לנו לבצע מדידות כמותיות של סמנים neurotoxicity כגון מספר העצבית, לספור neurite ואורך neurite. ב האסטרוציטים, דבקת תגובתי היא סמן ביולוגי ידוע neurotoxicity, מאופיין על ידי שינויים בביטוי GFAP, מספר astrocyte ומורפולוגיה astrocyte. אנחנו הוכיחו כי כל נקודות הקצה אלה עשויים בקלות להעריך באמצעות HCA. מחקרים אלה תומכים מושג HCA של עצבי ספציפי סמנים ביולוגיים יכול לשמש כחלק סוללה של בדיקות in vitro במהירות המסך מספר רב של כימיקלים עבור נקודות קצה neurotoxic. HCS222 ניתוח גבוהה של Millipore תוכן הערכה לתרבות משותפת של נוירונים האסטרוציטים מורכבת באיכות גבוהה ריאגנטים איתור פרוטוקולים בו זמנית פרופיל βIII-טובולין ו - גליה חלבון fibrillary חומצי (GFAP) במגוון רחב של דגמים סלולריים של neurotoxicity. הפערים תוקף ריאגנטים מסופק עם ערכה זו מאפשרת למשתמש לבצע סטנדרטיזציה של מבחני, למזער assay-to-assay השתנות, וכן reproducibly להפיק תמונות עם יחס אות רקע גבוה.

<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Rabbit Anti-&#x03B2;III-Tubulin HCS Primary Antibody, 100X</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Part No. CS201672</td>
<td>1 vial containing 300 &micro;L 
Millipore HCS222 Kit Component</td>
</tr>
<tr>
<td>HCS Secondary Antibody (donkey anti-rabbit IgG, FITC conjugate), 200X</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Part No. CS201649</td>
<td>1 vial containing 150 &micro;L Millipore HCS222 Kit Component</td>
</tr>
<tr>
<td>Mouse Anti-GFAP HCS Primary Antibody, 100X</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Part No. CS201671</td>
<td>1 vial containing 300 &micro;L Millipore HCS222 Kit Component</td>
</tr>
<tr>
<td>HCS Secondary Antibody (donkey anti-mouse IgG, Cy3 conjugate), 200X</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Part No. CS200437</td>
<td>1 vial containing 150 &micro;L Millipore HCS222 Kit Component</td>
</tr>
<tr>
<td>Hoechst HCS Nuclear Stain, 200X</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Part No. CS200438</td>
<td>1 vial containing 150 &micro;L Millipore HCS222 Kit Component</td>
</tr>
<tr>
<td>HCS Fixation Solution with Phenol Red, 2X</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Part No. CS200434</td>
<td>1 bottle containing 100 mL Millipore HCS222 Kit Component</td>
</tr>
<tr>
<td>HCS Immunofluorescence Buffer, 1X</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Part No. CS200435</td>
<td>1 bottle containing 1000 mL Millipore HCS222 Kit Component</td>
</tr>
<tr>
<td>HCS Wash Buffer, 1X</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Part No. 2007643</td>
<td>1 bottle containing 500 mL Millipore HCS222 Kit Components</td>
</tr>
<tr>
<td>Acrylamide (Control Compound), 10X</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Part No. CS201679</td>
<td>1 vial containing 500 &micro;L of 1M acrylamide in dH2O Millipore HCS222 Kit Component</td>
</tr>
<tr>
<td>Hydrogen Peroxide (Control Compound), 10X</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Part No. CS201730</td>
<td>1 vial containing 500 &micro;L of 100 mM hydrogen peroxide in dH2O Millipore HCS222 Kit Components</td>
</tr>
<tr>
<td>K-252a (Control Compound), 250X</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Part No. CS201741</td>
<td>1 vial containing 100 &micro;L of 250 &micro;M K-252a in DMSO Millipore HCS222 Kit Component</td>
</tr>
<tr>
<td>DMSO for Compound Serial Dilution</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Part No. CS200441</td>
<td>1 bottle containing 10 mL Millipore HCS222 Kit Component</td>
</tr>
<tr>
<td>Compound Dilution Buffer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Part No. CS200442</td>
<td>1 bottle containing 25 mL Millipore HCS222 Kit Component</td>
</tr>
<tr>
<td>Plate Sealers</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Part No. CS200443</td>
<td>10 each Millipore HCS222 Kit Components</td>
</tr>
<tr>
<td>tissue culture-treated black/clear bottom microplates </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>HCS imaging/analysis system</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>

a neuronal and astrocyte co-culture assay for high content analysis of neurotoxicity

גבוהה ניתוח תוכן (HCA) מבחני לשלב תאים ריאגנטים זיהוי עם הדמיה אוטומטיות עוצמה לניתוח אלגוריתמים תמונה, המאפשר מדידה של פנוטיפים הסלולר מרובים בתוך assay אחד. במחקר הנוכחי, השתמשנו HCA לפתח assay הרומן neurotoxicity. Neurotoxicity הערכה מהווה חלק חשוב של הערכה בטיחות התרופה, כמו גם להיות מוקד משמעותי של מאמצי הגנת הסביבה. בנוסף, neurotoxicity גם היטב קיבל<em&gt; במבחנה</em&gt; סמן להתפתחות מחלות ניווניות כגון אלצהיימר ופרקינסון. לאחרונה, היישום של HCA להקרנה עצבית דווחה. על ידי סימון תאים עצביים עם טובולין-βIII, מבחני HCA יכול לספק תפוקה גבוהה, לא סובייקטיבית, מדידות כמותית של פרמטרים כגון מספר העצבית, לספור neurite ואורך neurite, כל אשר יכול להצביע על ההשפעות הנוירו. עם זאת, התפקיד של האסטרוציטים נשאר נחקרו במודלים אלה. האסטרוציטים יש תפקיד אינטגרלי בשמירה על איזון מערכת העצבים המרכזית (CNS), והן קשורות עם neuroprotection והן neurodegradation כאשר הם מופעלים בתגובה חומרים רעילים או מצבי מחלה. GFAP הוא חלבון נימה ביניים הביעו בעיקר האסטרוציטים של מערכת העצבים המרכזית. הפעלת Astrocytic (דבקת) מוביל upregulation של GFAP, מלווה בדרך כלל על ידי הפצת היפרטרופיה astrocyte ו. תהליך זה של דבקת תגובתי הוצע כסמן מוקדם של נזק למערכת העצבים. השיטה המסורתית quantitation GFAP היא immunoassay. גישה זו היא מוגבלת על ידי חוסר יכולת לספק מידע על לוקליזציה מורפולוגיה הסלולר, ומספר התא. אנו נקבע כי HCA יכול לשמש כדי להתגבר על המגבלות האלה ואת למדוד בו זמנית מספר רב של תכונות הקשורות דבקת - שינויים בביטוי GFAP, היפרטרופיה astrocyte, ושגשוגם astrocyte - בתוך assay אחד. בשנת שיתוף תרבות מחקרים, האסטרוציטים הוכחו להגן על הנוירונים מפני מספר סוגים של עלבון רעילים כדי להשפיע באופן קריטי להישרדות עצביים. מחקרים שנעשו לאחרונה הראו כי השימוש האסטרוציטים ב<em&gt; במבחנה</em&gt; מבחן מערכת neurotoxicity עשוי להוכיח רלוונטיות יותר מבנה מערכת העצבים המרכזית לתפקד האדם מאשר תאים עצביים לבד. בהתאם לכך, פיתחנו assay HCA לתרבות משותפת של נוירונים האסטרוציטים, המורכב פרוטוקולים תוקף, יעד ספציפי ריאגנטים עבור זיהוי פרופיל βIII-טובולין וחלבון גליה fibrillary חומצי (GFAP). Assay זה מאפשר ניתוח סימולטני של neurotoxicity, תולדה neurite, דבקת, מורפולוגיה עצב astrocytic ופיתוח עצב astrocytic במגוון רחב של דגמים סלולריים, המייצג את רומן, לא סובייקטיבית, תפוקה גבוהה assay להערכה neurotoxicity. Assay מחזיקה פוטנציאל גדול לאיתור משופרת של neurotoxicity פרודוקטיביות משופרת במדעי המוח מחקר גילוי תרופות.

Watch this Scientific Journal Video about A Neuronal and Astrocyte Co-Culture Assay for High Content Analysis of Neurotoxicity at JoVE.com

A Neuronal and Astrocyte Co-Culture Assay for High Content Analysis of Neurotoxicity

מאמר זה מתאר פרוטוקול מגיב רומן ולהגדיר מיועד מדידה רגישה של ההשפעות הנוירו של תרכובות וטיפולים על שיתוף תרבויות של נוירונים האסטרוציטים באמצעות ניתוח תוכן גבוהה. תוצאות מראים כי ניתוח תוכן גבוהה מהווה טכנולוגיה חדשנית מרגש להערכה neurotoxicity.

עצב Astrocyte שותף תרבות Assay לניתוח תכולה גבוהה של neurotoxicity

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing ...

Research

JoVE Journal

Biology

Neuronal Cell Cultures from Aplysia for High-Resolution Imaging of Growth Cones

תא תרבויות העצבית מ Aplysia עבור הדמיה ברזולוציה גבוהה של קונוסים צמיחה

Neuronal growth cones are the highly motile structures at the tip of axons that can detect guidance cues in the environment and transduce this information ...

A Multi-compartment CNS Neuron-glia Co-culture Microfluidic Platform

תא Multi-CNS-Neuron גליה שותף תרבות Microfluidic רציף

We present a novel multi-compartment neuron co-culture microsystem platform for in vitro CNS axon-glia interaction research, capable of conducting up to ...

Microfluidic Co-culture of Epithelial Cells and Bacteria for Investigating Soluble Signal-mediated Interactions

Microfluidic משותף התרבות של תאים וחיידקים אפיתל לחקירת מסיסים אותות בתיווך אינטראקציות

The human gastrointestinal (GI) tract is a unique environment in which intestinal epithelial cells and non-pathogenic (commensal) bacteria coexist. It has ...

Analysis of Schwann-astrocyte Interactions Using In Vitro Assays

Analysis of Schwann-astrocyte Interactions Using In Vitro Assays

ניתוח של שוואן-astrocyte אינטראקציות שימוש במבחנה מבחני

Schwann cells are one of the commonly used cells in repair strategies following spinal cord injuries. Schwann cells are capable of supporting axonal ...

Quantification of dsDNA using the Hitachi F-7000 Fluorescence Spectrophotometer and PicoGreen Dye

כימות dsDNA באמצעות ה-F-7000 Hitachi Fluorescence ספקטרופוטומטר ו PicoGreen דיי

Quantification of DNA, especially in small concentrations, is an important task with a wide range of biological applications including standard molecular ...

Absolute Quantum Yield Measurement of Powder Samples

מדידה אבסולוטית קוונטית תשואה של דוגמאות אבקת

Measurement of fluorescence quantum yield has become an important tool in the search for new solutions in the development, evaluation, quality control and ...

A High-content Imaging Workflow to Study Grb2 Signaling Complexes by Expression Cloning

הדמית עבודה גבוהה תוכן ללמוד Grb2 מכלולי איתות על ידי שיבוט ביטוי

Signal  transduction by growth factor receptors is essential for cells to maintain  proliferation and differentiation and requires tight control. Signal  ...

A High Throughput MHC II Binding Assay for Quantitative Analysis of Peptide Epitopes

Assay עקידת התפוקה גבוה MHC II לניתוח כמותי של פפטיד אפיטופים

Biochemical assays with recombinant human MHC II molecules can provide rapid, quantitative insights into immunogenic epitope identification, deletion, or ...

qPCRTag Analysis - A High Throughput, Real Time PCR Assay for Sc2.0 Genotyping

qPCRTag ניתוח - תפוקה גבוהה, בזמן אמת PCR Assay עבור Genotyping Sc2.0

The Synthetic Yeast Genome Project (Sc2.0) aims to build 16 designer yeast chromosomes and combine them into a single yeast cell. To date one synthetic ...

High Content Screening Analysis to Evaluate the Toxicological Effects of Harmful and Potentially Harmful Constituents (HPHC)

High Content Screening Analysis to Evaluate the Toxicological Effects of Harmful and Potentially Harmful Constituents HPHC

ניתוח הקרנת תכולה גבוהה כדי להעריך את ההשפעות טוקסיקולוגי של מזיקים מזיקים מרכיבים (HPHC)

Cigarette smoke (CS) is a major risk factor for cardiovascular and lung diseases. Because CS is a complex aerosol containing more than 7,000 chemicals1 it ...