Name: proteomics to identify proteins interacting with p2x2 ligand-gated cation channels
Uploaded: 2009-05-18T23:00:00
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SWとTMVは、国立衛生研究所のNCRRとNHLBIでサポートされています。 BSKとHSは、国立衛生研究所のNINDSとNIGMSでサポートされています。

実験手順実験手順（図2）は以下の段階的な方法で説明されている4つの部分から構成されています。 パート1：P2X2受容体のC末端のサブクローニングおよび発現。 我々はそれが結合する脳のタンパク質を同定するために全長細菌におけるP2X2受容体のC末端を表明している。 <ol><li> P2X2受容体のC末端（残基353〜472）（図1）pGEX 4NT1（GE?...

<ol>
	<li>Hille, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Ion channels of excitable membranes. , (2001).</li><li>Khakh, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+physiology+of+P2X+receptors+and+ATP+signalling+at+synapses.">Molecular physiology of P2X receptors and ATP signalling at synapses.</a> Nat Rev Neurosci. 2, 165-174 (2001).</li><li>Egan, T. M., Khakh, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contribution+of+calcium+ions+to+P2X+channel+responses.">Contribution of calcium ions to P2X channel responses.</a> J Neurosci. 24, 3413-3420 (2004).</li><li>Burnashev, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+permeability+of+ligand-gated+channels.">Calcium permeability of ligand-gated channels.</a> Cell Calcium. 24, 325-332 (1998).</li><li>Clapham, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+signaling.">Calcium signaling.</a> Cell. 131, 1047-1058 (2007).</li><li>Levitan, I. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signaling+protein+complexes+associated+with+neuronal+ion+channels.">Signaling protein complexes associated with neuronal ion channels.</a> Nat Neurosci. 9, 305-310 (2006).</li><li>Khakh, B. S., North, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=P2X+receptors+as+cell-surface+ATP+sensors+in+health+and+disease.">P2X receptors as cell-surface ATP sensors in health and disease.</a> Nature. 442, 527-532 (2006).</li><li>Roger, S., Pelegrin, P., Surprenant, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Facilitation+of+P2X7+receptor+currents+and+membrane+blebbing+via+constitutive+and+dynamic+calmodulin+binding.">Facilitation of P2X7 receptor currents and membrane blebbing via constitutive and dynamic calmodulin binding.</a> J Neurosci. 28, 6393-6401 (2008).</li><li>North, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+physiology+of+P2X+receptors.">Molecular physiology of P2X receptors.</a> Physiol Rev. 82, 1013-1067 (2002).</li><li>Khakh, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=International+union+of+pharmacology.+XXIV.+Current+status+of+the+nomenclature+and+properties+of+P2X+receptors+and+their+subunits..">International union of pharmacology. XXIV. Current status of the nomenclature and properties of P2X receptors and their subunits..</a> Pharmacol Rev. 53, 107-118 (2001).</li><li>Young, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+shape,+architecture+and+size+of+P2X4+receptors+determined+using+fluorescence+resonance+energy+transfer+and+electron+microscopy.">Molecular shape, architecture and size of P2X4 receptors determined using fluorescence resonance energy transfer and electron microscopy.</a> J Biol Chem. 283, 26241-26251 (2008).</li><li>Edmondson, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+kinase+C+epsilon+signaling+complexes+include+metabolism-+and+transcription/translation-related+proteins:+complimentary+separation+techniques+with+LC/MS/MS.">Protein kinase C epsilon signaling complexes include metabolism- and transcription/translation-related proteins: complimentary separation techniques with LC/MS/MS.</a> Mol Cell Proteomics. 1, 421-433 (2002).</li><li>Evans, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Orthosteric+and+allosteric+binding+sites+of+P2X+receptors.">Orthosteric and allosteric binding sites of P2X receptors.</a> Eur Biophys J. 38, 319-327 (2009).</li></ol>

イオンチャネルは、膜内在性タンパク質の主要なクラスです。彼らは選択的に形質膜を横断し、その電気化学的勾配下にイオンの移動を可能にする水の満たされた気孔が含まれています。開いた状態および閉じた状態との間のイオンチャネルのゲート。ゲーティングのステップは、P2Xリガンド依存性イオンチャネルの場合の送信機（例：ATP）によって引き起こされる、またはそれが他のタン?...

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Acetonitrile</td>
<td>Reagent</td>
<td>JT Baker</td>
<td>9829-02</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Acrylamide</td>
<td>Reagent</td>
<td>BIO-RAD</td>
<td>161-0156</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Ampicillin</td>
<td>Reagent</td>
<td>VWR</td>
<td>VW1507-01</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Ammonium Bicarbonate</td>
<td>Reagent</td>
<td>Fluka</td>
<td>09830</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Ammonium Persulphate (APS)</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>A3678</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Adenosine Triphosphate (ATP)</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>A7699</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Bradford reagent</td>
<td>Reagent</td>
<td>BIO-RAD</td>
<td>500-0006</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Bromophenol blue</td>
<td>Reagent</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>B-392</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Commassie blue R-250</td>
<td>Reagent</td>
<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
<td>Sc-24972</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dithiotritol (DTT)</td>
<td>Reagent</td>
<td>EMD</td>
<td>3860</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
<td>Reagent</td>
<td>VWR</td>
<td>VW1474-01</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Ethylene Glycol tetraacetic acid (EGTA)</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>E8145</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Formic acid</td>
<td>Reagent</td>
<td>EMD</td>
<td>11670-1</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Glutathione Sepharose 4B beads</td>
<td>Reagent</td>
<td>GE Healthcare</td>
<td>17-5132-01</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Hydrochloric acid (HCl)</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>H1758</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside (IPTG)</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>15502</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Iodoacetamide</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>I1149</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Luria-Bertani (LB) Media</td>
<td>Reagent</td>
<td>EMD</td>
<td>1.00547.5007</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Leupeptin</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>L8511</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Lysozyme</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>62971</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Magnesium Sulphate (MgSO4)</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>S7653</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sodium Chloride (NaCl)</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>S3014</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sodium Flouride (NaF)</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>S7920</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sodium Orthovanadate (Na3VO4)</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>S6508</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Nonidet P40</td>
<td>Reagent</td>
<td>Fluka</td>
<td>74385</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Phenylmethanesulphonylfluoride (PMSF)</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>P7626</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Protease inhibitor tablet</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>S8820</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Protein standard </td>
<td>Reagent</td>
<td>BIO-RAD</td>
<td>161-0305</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sarkosyl</td>
<td>Reagent</td>
<td>Acros</td>
<td>61207</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Screw top vial</td>
<td>Tool</td>
<td>Agilent Technologies</td>
<td>5182-0866</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sodium dodecyl sulfate</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>L4509</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>SYPRO&#174; Ruby protein gel stain</td>
<td>Reagent</td>
<td>BIO-RAD</td>
<td>170-3125</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine (TEMED)</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>T9281</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Tris base</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>T1503</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Triton X-100</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>T9284</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Trypsin</td>
<td>Reagent</td>
<td>Promega</td>
<td>V5111</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Tween 20</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>P5927</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Water</td>
<td>Reagent</td>
<td>Burdick&Jackson</td>
<td>365-4</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>LTQ-Orbitrap tandem mass spectrometer</td>
<td>Tool</td>
<td>ThermoFisher Scientific</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Nano Liquid Chromatography System</td>
<td>Tool</td>
<td>Eksigent</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>B-Mercaptoethanol</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>M6250</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Glycerol</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>EMD</td>
<td>GX0185-6</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

proteomics to identify proteins interacting with p2x2 ligand-gated cation channels

リガンド依存性イオンチャネルは神経系1でシナプスのコミュニケーションを貫く。システインループ、グルタミン酸ゲートおよびP2X受容体チャネル2：哺乳類ではリガンド依存性チャネルの3つのファミリがあります。それぞれの場合に送信機の結合はイオンが電気化学的勾配を流れに経由する細孔の開口部につながる。多くのリガンド依存性チャネルは、またダウンストリームチャネルの開口部の持続時間を超える可能性の役割5（例えば、遺伝子の調節）をシグナリングしているカルシウムイオン3、4、に透過性である。したがって、リガンド依存性チャネルは、数ミリ秒から数日までの幅広い時間スケールで信号を送ることができる。これらの重要な役割を考えるとそれはそれ自体がタンパク質、そしてどのようにこれらのタンパク質は、シグナル伝達に調整できることで規制されている方法リガンド依存性イオンチャネルを理解する必要があります。最近の研究では、多くが、すべてではありませんが、チャンネルは蛋白質シグナル伝達複合体6の一部である可能性を示唆している。この記事では、P2X2受容体細胞質ドメインのC末端の側面に結合するタンパク質を同定する方法を説明します。 P2X受容体はATP依存性陽イオンチャネルであり、7つのサブユニット（P2X1 - P2X7）で構成されています。 P2X受容体は広く彼らは興奮性シナプス伝達や神経伝達物質放出7のシナプス前促通を媒介する脳、で表されます。 P2X受容体は興奮性および非興奮性細胞に存在し、神経細胞シグナリング、炎症と心血管機能8で重要な役割を仲介している。 P2X2受容体は神経系9に豊富であり、この研究の焦点です。各P2Xサブユニットは細胞外領域7と細胞内のNおよびC末端（図1a）7によって分離された二つの膜貫通セグメント（TM1＆TM2）を持つと考えられている。 P2Xサブユニット10は、（P2X1 - P2X7）アミノ酸レベル11で30〜50％の配列相同性を示す。 P2X受容体はイオンチャネル型受容体の中で最も単純な化学量論であるのみ3つのサブユニットが含まれています。 P2X2のC -末端は120アミノ酸（図1b）を構成され、P2X2受容体のシグナル伝達複合体の一部である可能性があるという仮説を支持する、いくつかのタンパク質のドッキングのコンセンサス部位が含まれています。いくつかの機能がP2X2受容体9のない研究のC -末端に起因しているが、しかし、全長C末端を介して、このタンパク質の細胞内側に結合する分子のパートナーを説明しました。この方法を本稿では、P2X2受容体の全長C末端と相互作用するタンパク質を同定するプロテオミクスアプローチを説明します。

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Proteomics to Identify Proteins Interacting with P2X2 Ligand-Gated Cation Channels

我々は、ATP依存性P2X2受容体の全長のC末端に結合する脳の蛋白質を識別するための単純なプロトコルを記述する。すべてのP2X受容体へのこのアプローチの拡張と体系的なアプリケーションは、P2X受容体シグナル伝達の理解につながることが期待される。

P2X2リガンド依存性陽イオンチャネルと相互作用するタンパク質を特定するためのプロテオミクス

Ligand-gated ion channels underlie synaptic communication in the nervous system1. In mammals there are three families of ligand-gated channels: the cys ...

Research

JoVE Journal

Biology

Identification of protein complexes with quantitative proteomics in S. cerevisiae

S. cerevisiaeの定量的プロテオミクスとタンパク質の複合体の同定

Lipids are the building blocks of cellular membranes that function as barriers and in compartmentalization of cellular processes, and recently, as ...

PAR-CliP - A Method to Identify Transcriptome-wide the Binding Sites of RNA Binding Proteins

PAR -クリップ - RNA結合タンパク質のトランスクリプトーム全体の結合部位を同定する方法

RNA transcripts are subjected to post-transcriptional gene regulation by interacting with hundreds of RNA-binding proteins (RBPs) and microRNA-containing ...

Using SCOPE to Identify Potential Regulatory Motifs in Coregulated Genes

Coregulated遺伝子の潜在的な規制モチーフを特定するためにスコープの使用

SCOPE is an ensemble motif finder that uses three component algorithms in parallel to identify potential regulatory motifs by over-representation and ...

Quantification of Proteins Using Peptide Immunoaffinity Enrichment Coupled with Mass Spectrometry

質量分析法とあいまってペプチドイムノエンリッチメントを使用したタンパク質の定量化

There is a great need for quantitative assays in measuring proteins. Traditional sandwich immunoassays, largely considered the gold standard in ...

High-throughput Crystallization of Membrane Proteins Using the Lipidic Bicelle Method

脂質Bicelle法を用いた膜タンパク質のハイスループット結晶化

Membrane proteins (MPs) play a critical role in many physiological processes such as pumping specific molecules across the otherwise impermeable membrane ...

Modified Yeast-Two-Hybrid System to Identify Proteins Interacting with the Growth Factor Progranulin

成長因子Progranulinと相互作用するタンパク質を識別するように変更酵母ツーハイブリッドシステム

Progranulin (PGRN), also known as granulin epithelin precursor (GEP), is a 593-amino-acid autocrine growth factor. PGRN is known to play a critical role ...

Reverse Yeast Two-hybrid System to Identify Mammalian Nuclear Receptor Residues that Interact with Ligands and/or Antagonists

相互作用するリガンドおよび/またはアンタゴニストと、哺乳動物核内受容体残基を同定するために逆酵母ツーハイブリッドシステム

As a critical regulator of drug metabolism and inflammation, Pregnane X Receptor (PXR), plays an important role in disease pathophysiology linking ...

Bottom-up and Shotgun Proteomics to Identify a Comprehensive Cochlear Proteome

総合蝸牛プロテオームを識別するために、ボトムアップとショットガンプロテオミクス

Proteomics is a commonly used approach that can provide insights into complex biological systems. The cochlear sensory epithelium contains receptors that ...

Glycopeptide Capture for Cell Surface Proteomics

細胞表面プロテオミクスのための糖ペプチドキャプチャ

Cell surface proteins, including extracellular matrix proteins, participate in all major cellular processes and functions, such as growth, ...

Capture Compound Mass Spectrometry - A Powerful Tool to Identify Novel c-di-GMP Effector Proteins

捕獲化合物質量分析 - 小説のc-ジ-GMPエフェクタータンパク質を同定するための強力なツール

Considerable progress has been made during the last decade towards the identification and characterization of enzymes involved in the synthesis ...