Name: proteomics to identify proteins interacting with p2x2 ligand-gated cation channels
Uploaded: 2009-05-18T23:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Proteomics to Identify Proteins Interacting with P2X2 Ligand-Gated Cation Channels at JoVE.com

SW och TMV stöds av NCRR och NHLBI vid National Institutes of Health. BSK och HS stöds av NINDS och NIGMS av National Institutes of Health.

Experimentella Den experimentella förfarandet (Fig. 2) består av fyra delar som beskrivs i en stegvis sätt nedan. Del 1: Subcloning och uttryck i C-ändstationen av P2X2 receptorer. Vi har uttryckt fulla längd C-terminala P2X2 receptorer i bakterier för att identifiera hjärnan proteiner som den binder. <ol><li> C-terminus (rester från 353 till 472) av P2X2 receptorn (Figur 1) var förökas med PCR, klonade i pGEX 4NT1 (GE Life ...

<ol>
	<li>Hille, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Ion channels of excitable membranes. , (2001).</li><li>Khakh, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+physiology+of+P2X+receptors+and+ATP+signalling+at+synapses.">Molecular physiology of P2X receptors and ATP signalling at synapses.</a> Nat Rev Neurosci. 2, 165-174 (2001).</li><li>Egan, T. M., Khakh, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contribution+of+calcium+ions+to+P2X+channel+responses.">Contribution of calcium ions to P2X channel responses.</a> J Neurosci. 24, 3413-3420 (2004).</li><li>Burnashev, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+permeability+of+ligand-gated+channels.">Calcium permeability of ligand-gated channels.</a> Cell Calcium. 24, 325-332 (1998).</li><li>Clapham, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+signaling.">Calcium signaling.</a> Cell. 131, 1047-1058 (2007).</li><li>Levitan, I. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signaling+protein+complexes+associated+with+neuronal+ion+channels.">Signaling protein complexes associated with neuronal ion channels.</a> Nat Neurosci. 9, 305-310 (2006).</li><li>Khakh, B. S., North, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=P2X+receptors+as+cell-surface+ATP+sensors+in+health+and+disease.">P2X receptors as cell-surface ATP sensors in health and disease.</a> Nature. 442, 527-532 (2006).</li><li>Roger, S., Pelegrin, P., Surprenant, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Facilitation+of+P2X7+receptor+currents+and+membrane+blebbing+via+constitutive+and+dynamic+calmodulin+binding.">Facilitation of P2X7 receptor currents and membrane blebbing via constitutive and dynamic calmodulin binding.</a> J Neurosci. 28, 6393-6401 (2008).</li><li>North, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+physiology+of+P2X+receptors.">Molecular physiology of P2X receptors.</a> Physiol Rev. 82, 1013-1067 (2002).</li><li>Khakh, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=International+union+of+pharmacology.+XXIV.+Current+status+of+the+nomenclature+and+properties+of+P2X+receptors+and+their+subunits..">International union of pharmacology. XXIV. Current status of the nomenclature and properties of P2X receptors and their subunits..</a> Pharmacol Rev. 53, 107-118 (2001).</li><li>Young, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+shape,+architecture+and+size+of+P2X4+receptors+determined+using+fluorescence+resonance+energy+transfer+and+electron+microscopy.">Molecular shape, architecture and size of P2X4 receptors determined using fluorescence resonance energy transfer and electron microscopy.</a> J Biol Chem. 283, 26241-26251 (2008).</li><li>Edmondson, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+kinase+C+epsilon+signaling+complexes+include+metabolism-+and+transcription/translation-related+proteins:+complimentary+separation+techniques+with+LC/MS/MS.">Protein kinase C epsilon signaling complexes include metabolism- and transcription/translation-related proteins: complimentary separation techniques with LC/MS/MS.</a> Mol Cell Proteomics. 1, 421-433 (2002).</li><li>Evans, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Orthosteric+and+allosteric+binding+sites+of+P2X+receptors.">Orthosteric and allosteric binding sites of P2X receptors.</a> Eur Biophys J. 38, 319-327 (2009).</li></ol>

Jonkanaler är en stor klass av integrerade membranproteiner. De innehåller vattenfyllda porer som selektivt tillåta förflyttning av joner ner sina elektrokemiska gradienter över plasmamembranet. Jonkanaler grind mellan öppna och slutna stater. Det gating steget är utlöses av sändare (t.ex. ATP) vid P2X ligandreglerade jonkanaler, eller det kan regleras av interaktioner med andra proteiner. Det senaste decenniet har bevittnat en ökning av vår förståelse av hur P2X receptorer binder ATP-13, men rol...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Acetonitrile</td>
<td>Reagent</td>
<td>JT Baker</td>
<td>9829-02</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Acrylamide</td>
<td>Reagent</td>
<td>BIO-RAD</td>
<td>161-0156</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Ampicillin</td>
<td>Reagent</td>
<td>VWR</td>
<td>VW1507-01</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Ammonium Bicarbonate</td>
<td>Reagent</td>
<td>Fluka</td>
<td>09830</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Ammonium Persulphate (APS)</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>A3678</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Adenosine Triphosphate (ATP)</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>A7699</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Bradford reagent</td>
<td>Reagent</td>
<td>BIO-RAD</td>
<td>500-0006</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Bromophenol blue</td>
<td>Reagent</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>B-392</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Commassie blue R-250</td>
<td>Reagent</td>
<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
<td>Sc-24972</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dithiotritol (DTT)</td>
<td>Reagent</td>
<td>EMD</td>
<td>3860</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
<td>Reagent</td>
<td>VWR</td>
<td>VW1474-01</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Ethylene Glycol tetraacetic acid (EGTA)</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>E8145</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Formic acid</td>
<td>Reagent</td>
<td>EMD</td>
<td>11670-1</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Glutathione Sepharose 4B beads</td>
<td>Reagent</td>
<td>GE Healthcare</td>
<td>17-5132-01</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Hydrochloric acid (HCl)</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>H1758</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside (IPTG)</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>15502</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Iodoacetamide</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>I1149</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Luria-Bertani (LB) Media</td>
<td>Reagent</td>
<td>EMD</td>
<td>1.00547.5007</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Leupeptin</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>L8511</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Lysozyme</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>62971</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Magnesium Sulphate (MgSO4)</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>S7653</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sodium Chloride (NaCl)</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>S3014</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sodium Flouride (NaF)</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>S7920</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sodium Orthovanadate (Na3VO4)</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>S6508</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Nonidet P40</td>
<td>Reagent</td>
<td>Fluka</td>
<td>74385</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Phenylmethanesulphonylfluoride (PMSF)</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>P7626</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Protease inhibitor tablet</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>S8820</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Protein standard </td>
<td>Reagent</td>
<td>BIO-RAD</td>
<td>161-0305</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sarkosyl</td>
<td>Reagent</td>
<td>Acros</td>
<td>61207</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Screw top vial</td>
<td>Tool</td>
<td>Agilent Technologies</td>
<td>5182-0866</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sodium dodecyl sulfate</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>L4509</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>SYPRO&#174; Ruby protein gel stain</td>
<td>Reagent</td>
<td>BIO-RAD</td>
<td>170-3125</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine (TEMED)</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>T9281</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Tris base</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>T1503</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Triton X-100</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>T9284</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Trypsin</td>
<td>Reagent</td>
<td>Promega</td>
<td>V5111</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Tween 20</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>P5927</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Water</td>
<td>Reagent</td>
<td>Burdick&Jackson</td>
<td>365-4</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>LTQ-Orbitrap tandem mass spectrometer</td>
<td>Tool</td>
<td>ThermoFisher Scientific</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Nano Liquid Chromatography System</td>
<td>Tool</td>
<td>Eksigent</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>B-Mercaptoethanol</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>M6250</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Glycerol</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>EMD</td>
<td>GX0185-6</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

proteomics to identify proteins interacting with p2x2 ligand-gated cation channels

Ligandreglerade jonkanaler ligger bakom synaptisk kommunikation i nervsystemet 1. Hos däggdjur finns det tre familjer av ligandreglerade kanaler: CYS slinga, glutamatreglerade och P2X kanalerna receptor 2. I varje fall bindning av sändare leder till öppnandet av en por genom vilken joner rinna ner sina elektrokemiska gradienter. Många ligandreglerade kanaler också släpper igenom kalciumjoner 3, 4, som nedströms har signalering roller fem (t.ex. genreglering) att ha längre varaktighet av kanal öppning. Således ligandreglerade kanaler kan signalera över breda tidsskalor från några få millisekunder till dagar. Med tanke på dessa viktiga roller är det nödvändigt att förstå hur ligandreglerade jonkanaler sig regleras av proteiner, och hur dessa proteiner kan ställa signalering. Färska studier tyder på att många, om inte alla, kan kanalerna vara en del av protein signalering komplex sex. I den här artikeln förklarar vi hur man kan identifiera de proteiner som binder till C-terminalen aspekter av P2X2 receptorn cytosoliska domän. P2X receptorer är ATP-gated munikationsvägar och består av sju subenheter (P2X1-P2X7). P2X receptorer är allmänt uttryckta i hjärnan, där de förmedlar excitatoriska synaptisk transmission och presynaptiska underlättande av signalsubstansen släpper 7. P2X receptorer finns i hetsiga och icke-retbara celler och medla nyckelroller i neuronal signalering, inflammation och kardiovaskulär funktion 8. P2X2 receptorer är rikligt i nervsystemet 9 och är i fokus för denna studie. Varje P2X subenhet är tänkt att ha två membran som spänner segment (TM1 &amp; TM2) separerade av ett extracellulärt region 7 och intracellulära N och C ändstationer (Fig 1a) 7. P2X subenheter 10 (P2X1-P2X7) visar 30-50% sekvenshomologi på aminosyra nivå 11. P2X receptorer innehåller bara tre subenheter, som är den enklaste stökiometri bland ionotropic receptorer. Den P2X2 C-terminal består av 120 aminosyror (Fig 1b) och innehåller flera protein webbplatser dockning konsensus, stöder hypotesen att P2X2 receptor kan vara en del av signalering komplex. Trots att flera funktioner har tillskrivits C-ändstationen av P2X2 receptorer 9 ingen studie har beskrivit de molekylära partners som par till den intracellulära sidan av detta protein via fulla längd C-terminal. I den här metoder dokument beskriver vi ett proteomik metod för att identifiera de proteiner som interagerar med full längd C-ändstationen av P2X2 receptorer.

Watch this Scientific Journal Video about Proteomics to Identify Proteins Interacting with P2X2 Ligand-Gated Cation Channels at JoVE.com

Proteomics to Identify Proteins Interacting with P2X2 Ligand-Gated Cation Channels

Vi beskriver ett enkelt protokoll för att identifiera hjärnan proteiner som binder till hela längden C ändstationen av ATP-gated P2X2 receptorer. Utbyggnaden och systematisk tillämpning av denna metod till alla P2X receptorer förväntas leda till en bättre förståelse för P2X receptor signalering.

Proteomik för att identifiera proteiner Interagera med P2X2 ligandreglerade munikationsvägar

Ligand-gated ion channels underlie synaptic communication in the nervous system1. In mammals there are three families of ligand-gated channels: the cys ...

Research

JoVE Journal

Biology

Identification of protein complexes with quantitative proteomics in S. cerevisiae

Kartläggning av protein komplex med kvantitativa proteomik i S. cerevisiae

Lipids are the building blocks of cellular membranes that function as barriers and in compartmentalization of cellular processes, and recently, as ...

PAR-CliP - A Method to Identify Transcriptome-wide the Binding Sites of RNA Binding Proteins

PAR-Clip - En metod för att identifiera transkriptom hela bindningar på RNA-proteiner

RNA transcripts are subjected to post-transcriptional gene regulation by interacting with hundreds of RNA-binding proteins (RBPs) and microRNA-containing ...

Using SCOPE to Identify Potential Regulatory Motifs in Coregulated Genes

Använda utrymme för att identifiera potentiella Regulatory motiv i Coregulated Gener

SCOPE is an ensemble motif finder that uses three component algorithms in parallel to identify potential regulatory motifs by over-representation and ...

Quantification of Proteins Using Peptide Immunoaffinity Enrichment Coupled with Mass Spectrometry

Kvantifiering av proteiner med Peptide Immunoaffinity Anrikning kombination med masspektrometri

There is a great need for quantitative assays in measuring proteins. Traditional sandwich immunoassays, largely considered the gold standard in ...

High-throughput Crystallization of Membrane Proteins Using the Lipidic Bicelle Method

Hög genomströmning Kristallisering av membranproteiner Använda Lipidic Bicelle Metod

Membrane proteins (MPs) play a critical role in many physiological processes such as pumping specific molecules across the otherwise impermeable membrane ...

Modified Yeast-Two-Hybrid System to Identify Proteins Interacting with the Growth Factor Progranulin

Modifierad jäst-Two-Hybrid System för att identifiera proteiner Interagera med Growth Factor Progranulin

Progranulin (PGRN), also known as granulin epithelin precursor (GEP), is a 593-amino-acid autocrine growth factor. PGRN is known to play a critical role ...

Reverse Yeast Two-hybrid System to Identify Mammalian Nuclear Receptor Residues that Interact with Ligands and/or Antagonists

Omvänd jäst två-hybridsystemet för att identifiera Mammalian Nuclear Receptor Stoder som interagerar med ligander och / eller-antagonister

As a critical regulator of drug metabolism and inflammation, Pregnane X Receptor (PXR), plays an important role in disease pathophysiology linking ...

Bottom-up and Shotgun Proteomics to Identify a Comprehensive Cochlear Proteome

Bottom-up och Shotgun Proteomics att identifiera en omfattande Cochlear Proteome

Proteomics is a commonly used approach that can provide insights into complex biological systems. The cochlear sensory epithelium contains receptors that ...

Glycopeptide Capture for Cell Surface Proteomics

Glykopeptider Capture för cellytan Proteomics

Cell surface proteins, including extracellular matrix proteins, participate in all major cellular processes and functions, such as growth, ...

Capture Compound Mass Spectrometry - A Powerful Tool to Identify Novel c-di-GMP Effector Proteins

Capture Compound masspektrometri - Ett kraftfullt verktyg för att identifiera nya c-di-GMP effektorproteiner

Considerable progress has been made during the last decade towards the identification and characterization of enzymes involved in the synthesis ...