Name: processing the loblolly pine ptgen2 cdna microarray
Uploaded: 2009-03-20T00:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Processing the Loblolly Pine PtGen2 cDNA Microarray at JoVE.com

L&#39;etichettatura, ibridazione, e protocolli di lavaggio nel presente documento contiene alcune modifiche a quelli sviluppati in precedenza dal Dr. J. Quackenbush mentre presso l&#39;Institute for Genomic Research (TIGR), il dottor Shawn Levy al Microarray Vanderbilt Shared Resource (VMSR), e il Dr. Rob Alba mentre al Boyce Thompson Institute, (ITV) Cornell University.

(Nota sezioni 1 - 4 Non dimostrato in video) Preparazione Cy-etichetta target cDNA Quello che segue è il protocollo che usiamo per la sintesi di cDNA da RNA pino loblolly totale e indiretta etichettatura cDNA microarray prima di ibridazioni. Anche se pochi, non banali sono state apportate modifiche, il protocollo sottostante è simile a quello nel manuale di istruzioni fornito con il kit SuperScript Invitrogen indiretta Etichettatura cDNA. <p class="jove_title...

<ol>
	<li>Lorenz, W. W., Sun, F., Liang, C., Kolychev, D., Wang, H., Zhao, X., Cordonnier-Pratt, M. M., Pratt, L. H., Dean, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Water+stress-responsive+genes+in+loblolly+pine+(Pinus+taeda)+roots+identified+by+analyses+of+expressed+sequence+tag+libraries.">Water stress-responsive genes in loblolly pine (Pinus taeda) roots identified by analyses of expressed sequence tag libraries.</a> Tree Physiol. 26, 1-16 (2006).</li><li>Lorenz, W. W., Dean, J. F. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> unpublished data. , .</li><li>Hegde, P., Qi, R., Abernathy, K., Gay, C., Dharap, S., Gaspard, R., Hughes, J. E., Snesrud, E., Lee, N., Quackenbush, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+concise+guide+to+cDNA+microarray+analysis.">A concise guide to cDNA microarray analysis.</a> Biotechniques. 29, 548-562 (2000).</li><li>Alba, R., Fei, Z., Payton, P., Liu, Y., Moore, S. L., Debbie, P., Cohn, J., D'Ascenzo, M., Gordon, J. S., Rose, J. K. C., Martin, G., Tanksley, S. D., Bouzayen, M., Molly, M., Jahn, M. M., Giovannoni, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ESTs,+cDNA+microarrays,+and+gene+expression+profiling:+tools+for+dissecting+plant+physiology+and+development.">ESTs, cDNA microarrays, and gene expression profiling: tools for dissecting plant physiology and development.</a> The Plant Journal. 39, 697-714 (2004).</li><li>Lorenz, W. W., Simões, M., Miguel, C., Dean, J. F. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+Gene+Expression+changes+in+Pinus+species+using+a+Loblolly+pine+cDNA+microarray.">Analysis of Gene Expression changes in Pinus species using a Loblolly pine cDNA microarray.</a> IUFRO-CTIA 2008 Joint Conference. , (2008).</li><li>Simões, M., Lorenz, W. W., Alba, A., Gonçalves, S., Dean, J., Miguel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+gene+expression+analysis+during+P.+pinaster+embryo+development.">Global gene expression analysis during P. pinaster embryo development.</a> 7th Plant Genomics European Meeting. , (2008).</li></ol>

PtGen2 è sviluppata di recente, cDNA microarray personalizzati che è stato progettato per essere utilizzato principalmente dalla comunità di ricerca loblolly pino. I risultati preliminari generato finora hanno mostrato l&#39;array di essere un valido strumento nella valutazione degli eventi trascrizionale che si verificano in risposta a stress idrico, così come nel monitoraggio dei cambiamenti che si verificano durante lo sviluppo embrionale in pino marittimo, Pinus pinaster 5,6 Abbiamo inoltre r...

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Pre-hybridization Buffer</td>
<td>Buffer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>5X SSC, 0.1% SDS, 1% BSA</td>
</tr>
<tr>
<td>Hybridization Buffer</td>
<td>Buffer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>30% formamide, 5X SSC, 5X Denhardt&#x2019;s, 1% PolyA RNA (Invitrogen, POLYA.GF), 0.1% SDS</td>
</tr>
<tr>
<td>Wash Solution #1</td>
<td>Buffer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>1X SSC, 0.2% SDS, preheat to 43&deg;C</td>
</tr>
<tr>
<td>Wash Solution #2</td>
<td>Buffer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>0.1X SSC, 0.2% SDS</td>
</tr>
<tr>
<td>Wash Solution #3</td>
<td>Buffer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>0.1X SSC</td>
</tr>
<tr>
<td>Isopropyl Alcohol</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma Aldrich</td>
<td>34959-2.5L</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>50mL Conical Tubes</td>
<td>Other</td>
<td>Falcon&#x2122;</td>
<td>352070</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>15mL Conical Tubes</td>
<td>Other</td>
<td>Falcon&#x2122;</td>
<td>352196</td>
<td>Use this or a similar cap placed at the bottom of each 50mL conical tube during centrifugation</td>
</tr>
<tr>
<td>Coplin Jar</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Wheaton&#x2122;</td>
<td>900520</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Staining Dish & Rack </td>
<td>Other</td>
<td>Wheaton&#x2122;</td>
<td>900200</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Albumin from bovine serum (BSA)</td>
<td>Other</td>
<td>Sigma&#x2122;</td>
<td>A-9418</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PolyA RNA</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen&#x2122;</td>
<td>POLYA.GF</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>SuperScriptTM Indirect cDNA Labeling </td>
<td>Kit</td>
<td>Invitrogen&#x2122;</td>
<td>L1014-02</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Turbo DNase</td>
<td>Kit</td>
<td>Ambion</td>
<td>AM1907</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>System</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cy-5 Dye</td>
<td>Reagent</td>
<td>GE&#x2122;</td>
<td>PA25001</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cy-3 Dye</td>
<td>Reagent</td>
<td>GE&#x2122;</td>
<td>PA23001</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>LifterSlips&trade;</td>
<td>Other</td>
<td>Erie Scientific Company&#x2122; </td>
<td>25X601</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>HybChambers</td>
<td>Equipment</td>
<td>GeneMachines</td>
<td>JHYB200003</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

processing the loblolly pine ptgen2 cdna microarray

PtGen2 è una caratteristica del DNA microarray 26.496 contenente amplificato EST pino loblolly. La serie è prodotta nel nostro laboratorio per l&#39;utilizzo da parte di ricercatori studiando l&#39;espressione genica in specie di pino ed altre conifere. PtGen2 è stato sviluppato come risultato degli sforzi gene nostra scoperta in pino loblolly, ed è composto da sequenze identificate principalmente dai tessuti radice, ma anche da ago e staminali. 1,2 PtGen2 è stato testato da ibridare differenti Cy-dye etichettati cDNA bersaglio di conifere , utilizzando sia amplificato e non amplificati modalità di etichettatura indiretti, e anche testato con una serie di condizioni di ibridazione e di lavaggio. Questo video si concentra sulla gestione e l&#39;elaborazione di diapositive prima e dopo la pre-ibridazione, così come dopo ibridazione, con alcune modifiche alle procedure sviluppate in precedenza. 3,4 inclusi anche, in forma di testo unico, sono i protocolli utilizzati per la generazione, l&#39;etichettatura e la pulizia di s cDNA bersaglio, così come informazioni sul software utilizzato per l&#39;elaborazione dei dati a valle. PtGen2 è stampato con un buffer di stampa proprietario che contiene alte concentrazioni di sale che possono essere difficili da rimuovere completamente. I vetrini vengono lavati prima di una soluzione calda SDS prima di pre-ibridazione. Dopo la pre-ibridazione, le diapositive vengono lavati con vigore in diversi cambiamenti di acqua per completare la rimozione dei sali rimanenti. LifterSlips ™ sono quindi puliti e posizionati sul diapositive e cDNA marcato è attentamente caricati sul microarray per mezzo di un&#39;azione capillare che prevede anche la distribuzione del campione lungo la diapositiva e riduce la possibilità di incorporazione bolla. Ibridazione degli obiettivi alla matrice avviene a 48 ° C in condizioni di elevata umidità. Dopo l&#39;ibridazione, una serie di lavaggi standard sono fatto a 53 ° C e temperatura ambiente per tempi prolungati. Elaborazione PtGen2 diapositive utilizzando questa tecnica riduce sale e SDS-derivati ​​artefatti spesso visto quando l&#39;array è un&#39;elaborazione meno rigorosamente. Ibridazione obiettivi derivanti da diverse fonti diverse conifere RNA, questo protocollo di elaborazione prodotto un minor numero di artefatti, sfondo ridotto, e ha fornito una migliore coerenza tra i diversi gruppi sperimentali di array.

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Processing the Loblolly Pine PtGen2 cDNA Microarray

Il cDNA microarray PtGen2 stato sviluppato per studi di espressione genica in pino loblolly,<em&gt; P. taeda</em&gt;, E altre specie di conifere. Qui mostriamo pre-e post-ibridazione manipolazione e il lavaggio delle tecniche che possono essere utilizzati con questo array per produrre una maggiore coerenza, manufatti ridotti e inferiori sfondi.

L&#39;elaborazione del Pino Loblolly PtGen2 cDNA Microarray

PtGen2 is a 26,496 feature cDNA microarray containing amplified loblolly pine ESTs.  The array is produced in our laboratory for use by researchers ...

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