Name: processing the loblolly pine ptgen2 cdna microarray
Uploaded: 2009-03-20T00:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Processing the Loblolly Pine PtGen2 cDNA Microarray at JoVE.com

Märkning, hybridisering och tvätt protokollen innehåller häri några ändringar av dessa tidigare utvecklat av Dr J. Quackenbush samtidigt som Institutet för genomisk forskning (TIGR), Dr Shawn Levy vid Vanderbilt Microarray Delad Resurs (VMSR), och Dr Rob Alba medan på Boyce Thompson Institute, (BKB) Cornell University.

(Observera avsnitt 1 till 4 inte påvisats i Video) Förbereda Cy-märkta Target cDNA Vad som följer är det protokoll som vi använder för cDNA syntes från total Loblolly tall RNA och indirekta cDNA märkning före microarray hybridizations. Även ett fåtal icke-triviala ändringar har gjorts, men protokollet nedan liknande den i bruksanvisningen som följer med Invitrogen är Upphöjd Indirekt cDNA Märkning Kit. Del 1: Första Stra...

<ol>
	<li>Lorenz, W. W., Sun, F., Liang, C., Kolychev, D., Wang, H., Zhao, X., Cordonnier-Pratt, M. M., Pratt, L. H., Dean, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Water+stress-responsive+genes+in+loblolly+pine+(Pinus+taeda)+roots+identified+by+analyses+of+expressed+sequence+tag+libraries.">Water stress-responsive genes in loblolly pine (Pinus taeda) roots identified by analyses of expressed sequence tag libraries.</a> Tree Physiol. 26, 1-16 (2006).</li><li>Lorenz, W. W., Dean, J. F. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> unpublished data. , .</li><li>Hegde, P., Qi, R., Abernathy, K., Gay, C., Dharap, S., Gaspard, R., Hughes, J. E., Snesrud, E., Lee, N., Quackenbush, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+concise+guide+to+cDNA+microarray+analysis.">A concise guide to cDNA microarray analysis.</a> Biotechniques. 29, 548-562 (2000).</li><li>Alba, R., Fei, Z., Payton, P., Liu, Y., Moore, S. L., Debbie, P., Cohn, J., D'Ascenzo, M., Gordon, J. S., Rose, J. K. C., Martin, G., Tanksley, S. D., Bouzayen, M., Molly, M., Jahn, M. M., Giovannoni, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ESTs,+cDNA+microarrays,+and+gene+expression+profiling:+tools+for+dissecting+plant+physiology+and+development.">ESTs, cDNA microarrays, and gene expression profiling: tools for dissecting plant physiology and development.</a> The Plant Journal. 39, 697-714 (2004).</li><li>Lorenz, W. W., Simões, M., Miguel, C., Dean, J. F. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+Gene+Expression+changes+in+Pinus+species+using+a+Loblolly+pine+cDNA+microarray.">Analysis of Gene Expression changes in Pinus species using a Loblolly pine cDNA microarray.</a> IUFRO-CTIA 2008 Joint Conference. , (2008).</li><li>Simões, M., Lorenz, W. W., Alba, A., Gonçalves, S., Dean, J., Miguel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+gene+expression+analysis+during+P.+pinaster+embryo+development.">Global gene expression analysis during P. pinaster embryo development.</a> 7th Plant Genomics European Meeting. , (2008).</li></ol>

PtGen2 är en nyligen utvecklad, anpassad cDNA microarray som var avsedd att användas främst av Loblolly tall forskarsamhället. Preliminära givit resultat hittills har visat arrayen att vara ett värdefullt verktyg i utvärderingen av transkriptionell händelser som inträffar till följd av torka stress, samt att övervaka förändringar som sker under embryots utveckling i maritima tall, Pinus pinaster 5,6 Vi har också nyligen visat att PtGen2 fungerar bra i över arter hybridizations med rikt...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Pre-hybridization Buffer</td>
<td>Buffer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>5X SSC, 0.1% SDS, 1% BSA</td>
</tr>
<tr>
<td>Hybridization Buffer</td>
<td>Buffer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>30% formamide, 5X SSC, 5X Denhardt&#x2019;s, 1% PolyA RNA (Invitrogen, POLYA.GF), 0.1% SDS</td>
</tr>
<tr>
<td>Wash Solution #1</td>
<td>Buffer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>1X SSC, 0.2% SDS, preheat to 43&deg;C</td>
</tr>
<tr>
<td>Wash Solution #2</td>
<td>Buffer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>0.1X SSC, 0.2% SDS</td>
</tr>
<tr>
<td>Wash Solution #3</td>
<td>Buffer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>0.1X SSC</td>
</tr>
<tr>
<td>Isopropyl Alcohol</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma Aldrich</td>
<td>34959-2.5L</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>50mL Conical Tubes</td>
<td>Other</td>
<td>Falcon&#x2122;</td>
<td>352070</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>15mL Conical Tubes</td>
<td>Other</td>
<td>Falcon&#x2122;</td>
<td>352196</td>
<td>Use this or a similar cap placed at the bottom of each 50mL conical tube during centrifugation</td>
</tr>
<tr>
<td>Coplin Jar</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Wheaton&#x2122;</td>
<td>900520</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Staining Dish & Rack </td>
<td>Other</td>
<td>Wheaton&#x2122;</td>
<td>900200</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Albumin from bovine serum (BSA)</td>
<td>Other</td>
<td>Sigma&#x2122;</td>
<td>A-9418</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PolyA RNA</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen&#x2122;</td>
<td>POLYA.GF</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>SuperScriptTM Indirect cDNA Labeling </td>
<td>Kit</td>
<td>Invitrogen&#x2122;</td>
<td>L1014-02</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Turbo DNase</td>
<td>Kit</td>
<td>Ambion</td>
<td>AM1907</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>System</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cy-5 Dye</td>
<td>Reagent</td>
<td>GE&#x2122;</td>
<td>PA25001</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cy-3 Dye</td>
<td>Reagent</td>
<td>GE&#x2122;</td>
<td>PA23001</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>LifterSlips&trade;</td>
<td>Other</td>
<td>Erie Scientific Company&#x2122; </td>
<td>25X601</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>HybChambers</td>
<td>Equipment</td>
<td>GeneMachines</td>
<td>JHYB200003</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

processing the loblolly pine ptgen2 cdna microarray

PtGen2 är en 26.496 funktion cDNA microarray innehåller förstärkta EST Loblolly furu. Matrisen är producerad i vårt laboratorium för att användas av forskare att studera genuttryck i furu och andra barrträd arter. PtGen2 utvecklades som ett resultat av våra ansträngningar genfynd i Loblolly furu och består av sekvenser identifieras främst från roten vävnader, men även från nål och stjälk. 1,2 PtGen2 har testats av hybridisering olika Cy-dye märkt barrträd mål cDNAs , med både förstärks och icke-förstärkta indirekta märkning metoder, och även testat med ett antal hybridisering och tvätt förhållanden. Denna video fokuserar på hantering och bearbetning av bilder före och efter pre-hybridisering, och efter hybridisering, med några ändringar av förfaranden som utvecklats tidigare. 3,4 ingår också, i textform bara är de protokoll som används för generering, märkning och sanering av mål cDNA s, samt information om programvara som används för nedströms databehandling. PtGen2 är tryckt med en egen utskrift buffert som innehåller höga halter av salt som kan vara svåra att få bort helt. Bilderna tvättas först i en varm SDS lösning innan pre-hybridisering. Efter pre-hybridisering, är bilderna tvättas kraftigt i flera byten av vatten för att fullständigt avlägsnande av återstående salter. LifterSlips ™ är sedan rengörs och placeras på bilderna och märkt cDNA är noga lastas på microarray genom kapillärkraft som innebär jämn fördelning av urvalet över bilden, och minskar risken för bubblan bolagsordningen. Hybridisering av mål för att matrisen sker vid 48 ° C i hög luftfuktighet. Efter hybridisering, är en serie av standard tvättar sker vid 53 ° C och rumstemperatur under längre tider. Bearbetning PtGen2 bilder med denna teknik minskar salt och SDS-derived artefakter ofta när matrisen behandlas mindre strängt. Hybridisering med utgångspunkt från flera olika barrträd RNA källor, gav denna behandling protokoll färre artefakter, minskad bakgrund och givit bättre konsekvens mellan olika experimentella grupper av matriser.

Watch this Scientific Journal Video about Processing the Loblolly Pine PtGen2 cDNA Microarray at JoVE.com

Processing the Loblolly Pine PtGen2 cDNA Microarray

Den cDNA microarray PtGen2 har utvecklats för studier genuttryck i Loblolly tall,<em&gt; P. taeda</em&gt; Och andra barrträd arter. Här visar vi pre-och post-hybridisering hantering och tvätt tekniker som kan användas med denna array ge bättre konsistens, minskade artefakter, och lägre bakgrunder.

Bearbetning av Loblolly Pine PtGen2 cDNA microarray

PtGen2 is a 26,496 feature cDNA microarray containing amplified loblolly pine ESTs.  The array is produced in our laboratory for use by researchers ...

Research

JoVE Journal

Biology

Gibberella zeae Ascospore Production and Collection for Microarray Experiments.

Gibberella zeae Ascospore Produktion och insamling för microarray experiment.

Fusarium graminearum Schwabe (teleomorph Gibberella zeae) is a plant pathogen causing scab disease on wheat and barley that reduces crop yield and grain ...

The Microfluidic Probe: Operation and Use for Localized Surface Processing

Den mikroflödessystem Probe: Drift och användning för lokaliserad ytbehandling

Microfluidic devices allow assays to be performed using minute amounts of sample and have recently been used to control the microenvironment of cells. ...

RNA Isolation from Embryonic Zebrafish and cDNA Synthesis for Gene Expression Analysis

RNA Isolering från embryonala Zebrafish och cDNA syntes för Gene Expression Analysis

Many important and complex laboratory procedures require an input of high quality, intact RNA.  A degraded sample or the presence of impurities can lead ...

Global Gene Expression Analysis Using a Zebrafish Oligonucleotide Microarray Platform

Global Gene Expression analys med en Zebrafish plattform Oligonucleotide microarray

Gene microarray technology permits quantitative measurement and gene expression profiling of transcript levels on a genome-wide basis. Gene microarray ...

Digital Microfluidics for Automated Proteomic Processing

Digital Mikrofluidik för automatiserad proteomik Processing

Clinical proteomics has emerged as an important new discipline, promising the discovery of biomarkers that will be useful for early diagnosis and ...

An Improved Method of RNA Isolation from Loblolly Pine (P. taeda L.) and Other Conifer Species

An Improved Method of RNA Isolation from Loblolly Pine P. taeda L. and Other Conifer Species

En förbättrad metod av RNA Isolering från Loblolly Pine ( P. taeda L.) och andra arter av barrträd

Tissues isolated from conifer species, particularly those belonging to the Pinaceae family, such as loblolly pine (Pinus taeda L.), contain high ...

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae

Microarray Analys för Saccharomyces cerevisiae</em

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen ...

Performing Custom MicroRNA Microarray Experiments

Utföra Custom Experiment MikroRNA Microarray

microRNAs (miRNAs) are a large family of &tilde; 22 nucleotides (nt) long RNA molecules that are widely expressed in eukaryotes 1.  Complex genomes encode ...

Analysis of RNA Processing Reactions Using Cell Free Systems: 3' End Cleavage of Pre-mRNA Substrates in vitro

Analysis of RNA Processing Reactions Using Cell Free Systems: 3' End Cleavage of Pre-mRNA Substrates in vitro

Analys av RNA Processing Reaktioner Använda Cell Free Systems: 3 &#39;End Cleavage av Pre-mRNA-substrat<em&gt; In vitro</em

The 3&#8217; end of mammalian mRNAs is not formed by abrupt termination of transcription by RNA polymerase II (RNPII). Instead, RNPII synthesizes ...

A Sectioning, Coring, and Image Processing Guide for High-Throughput Cortical Bone Sample Procurement and Analysis for Synchrotron Micro-CT

En sektions-, coring- och bildbehandlingsguide för hög genomströmning När benprovanskaffning och analys för synkrotronmikrotron micro-CT

Bone is a dynamic and mechanically active tissue that changes in structure over the human lifespan. The products of the bone remodeling process have been ...