Name: non-radioactive in situ hybridization protocol applicable for norway spruce and a range of plant species
Uploaded: 2009-04-17T00:00:00
Duration: 11 min 56 s
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Wir sind sehr dankbar, dass Anders Bovin der die Musik für unseren Film zur Verfügung gestellt und Michael Elliot Aktien freiwillig für den Dienst des Sprechers Stimme. Unterstützung wurde von Carl Trygger Foundation, die strategische Forschungsprogramm Landwirtschaft Functional Genomics (AgriFunGen) an der schwedischen Universität für Agrarwissenschaften, der schwedische Research Council (VR) und die schwedische Forschungsrat für Umwelt, Agrarwissenschaften und Raumplanung (FORMAS vorgesehen ).

<ol>
	<li>Carr, S. M., Irish, V. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Floral+homeotic+gene+expression+defines+developmental+arrest+stages+in+Brassica+oleracea+L.+vars.+botrytis+and+italica.">Floral homeotic gene expression defines developmental arrest stages in Brassica oleracea L. vars. botrytis and italica.</a> Planta. 201 (2), 179-188 (1997).</li><li>Coen, E. S., Meyerowitz, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+war+of+the+whorls:+genetic+interactions+controlling+flower+development.">The war of the whorls: genetic interactions controlling flower development.</a> Nature. 353 (6339), 31-37 (1991).</li><li>Jackson, D., Gurr, S. J., McPherson, M. J., Bowles, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+hybridization+in+plants.">In situ hybridization in plants.</a> Molecular Plant Patology: a practical approach. , (1991).</li><li>Leitch, A. R., Schwarzacher, T., Jackson, D., Leitch, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> In situ hybridization: a practical guide. , (1994).</li><li>Smyth, D. R., Bowman, J. L., Meyerowitz, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+flower+development+in+Arabidopsis.">Early flower development in Arabidopsis.</a> Plant Cell. 2 (8), 755-767 (1990).</li><li>Azevedo, H., Lino-Neto, T., Tavares, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+method+for+high-quality+RNA+isolation+from+needles+of+adult+maritime+pine+trees.">An improved method for high-quality RNA isolation from needles of adult maritime pine trees.</a> Plant Molecular Biology Reporter. , 333-338 (2003).</li><li>Sundstrom, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MADS-box+genes+active+in+developing+pollen+cones+of+Norway+spruce+(Picea+abies)+are+homologous+to+the+B-class+floral+homeotic+genes+in+angiosperms.">MADS-box genes active in developing pollen cones of Norway spruce (Picea abies) are homologous to the B-class floral homeotic genes in angiosperms.</a> Dev Genet. 25 (3), 253-266 (1999).</li><li>Tandre, K., Svenson, M., Svensson, M. 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U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MADS-box+genes+reveal+that+gnetophytes+are+more+closely+related+to+conifers+than+to+flowering+plants.">MADS-box genes reveal that gnetophytes are more closely related to conifers than to flowering plants.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (13), 7342-7347 (1999).</li><li>Savard, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chloroplast+and+nuclear+gene+sequences+indicate+late+Pennsylvanian+time+for+the+last+common+ancestor+of+extant+seed+plants.">Chloroplast and nuclear gene sequences indicate late Pennsylvanian time for the last common ancestor of extant seed plants.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 91 (11), 5163-5167 (1994).</li><li>Jack, T., Brockman, L. L., Meyerowitz, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+homeotic+gene+APETALA3+of+Arabidopsis+thaliana+encodes+a+MADS+box+and+is+expressed+in+petals+and+stamens.">The homeotic gene APETALA3 of Arabidopsis thaliana encodes a MADS box and is expressed in petals and stamens.</a> Cell. 68 (4), 683-697 (1992).</li><li>Bowman, J. L., Smyth, D. R., Meyerowitz, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genes+directing+flower+development+in+Arabidopsis.">Genes directing flower development in Arabidopsis.</a> Plant Cell. 1 (1), 37-52 (1989).</li><li>Kramer, E. M., Irish, V. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+genetic+mechanisms+controlling+petal+development.">Evolution of genetic mechanisms controlling petal development.</a> Nature. 399 (6732), 144-148 (1999).</li><li>Sundstrom, J., Engstrom, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conifer+reproductive+development+involves+B-type+MADS-box+genes+with+distinct+and+different+activities+in+male+organ+primordia.">Conifer reproductive development involves B-type MADS-box genes with distinct and different activities in male organ primordia.</a> Plant J. 31 (2), 161-169 (2002).</li><li>Carlsson, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microarray+analysis+reveals+altered+expression+of+a+large+number+of+nuclear+genes+in+developing+cytoplasmic+male+sterile+Brassica+napus+flowers.">Microarray analysis reveals altered expression of a large number of nuclear genes in developing cytoplasmic male sterile Brassica napus flowers.</a> Plant J. 49 (3), 452-462 (2007).</li><li>Teixeira, R. T., Farbos, I., Glimelius, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+levels+of+meristem+identity+and+homeotic+genes+are+modified+by+nuclear-mitochondrial+interactions+in+alloplasmic+male-sterile+lines+of+Brassica+napus.">Expression levels of meristem identity and homeotic genes are modified by nuclear-mitochondrial interactions in alloplasmic male-sterile lines of Brassica napus.</a> Plant J. 42 (5), 731-742 (2005).</li><li>Ying, S., Kay, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+technique+of+in+situ+hybridization.">The technique of in situ hybridization.</a> Methods in Molecular Medicine. 56, 263-283 (2001).</li></ol>

Zwei Aspekte des P. abies-Protokoll wurden im Vergleich zu den A. optimiert thaliana / B. napus-Protokoll, RNase-Behandlung und Proteinase K-Konzentration. Die RNase entfernt Hintergrund Signale und erhöht damit das Signal Spezifität 17. Die Proteinase K-Behandlung ist notwendig, um das Gewebe permeabilisieren so kann die Sonde geben und hybridisieren, die RNA-Pool von Interesse. Die DAL13 Antisense-Sonde hat einen höheren Signal ohne RNase-Behandlung (Abb. 3C, E, G) im Vergleich zu Abschnitten mit RNase für 30 min (Abbildung 2D, F und H) behandelt. Da die RNase-Behandlung nicht verbessert hat das Signal war es aus dem Protokoll entfernt. 1, 3 und 5 ug / ml; Die Proteinase K-Behandlung wurden bei drei verschiedenen Konzentrationen getestet. Im Fall von P. abies eine geringe oder gar kein Signal beobachtet wurde mit 1 pg / ml Proteinase K (Abb. 3C-D). Ein starkes Signal sowohl mit 3 ug / ml (Abb. 3E-F) und 5 g / ml erhalten wurde (Abb. 3G-H) Proteinase K. Da keine offensichtlichen Unterschiede in der Signalstärke gefunden wurde, wenn mit 5 ug / ml Proteinase K im Vergleich zu 3 g / ml, entschieden wir uns für 3 ug / ml in unserem Protokoll verwenden. Es ist wahrscheinlich, dass die Notwendigkeit einer höheren Proteinase K-Konzentration in der P. abies männlichen Zapfen, die A. im Vergleich thaliana und B. napus Blütenknospen ist darauf zurückzuführen, kompakter Gewebe mit höherer Phenole und Polysaccharide. Während der Fixierung und Einbettung einige Unterschiede zwischen den A. thaliana / B. napus-Protokoll und das P. abies-Protokoll sind evident. Das Gewebe von Interesse ist fest auf RNA Halt bietet und das ist ein kritischer Schritt, da schlecht festen Materialien eine geringe oder nicht nachweisbare Signal, obwohl die mRNA sehr reichlich vorhanden ist geben könnte. Das Gewebe wird entwässert, gelöscht und eingebettet in Wachs in allmählichen Veränderungen zu Gewebeschäden zu vermeiden, und in einigen Protokollen 0,85% NaCl wird das Ethanol in der Dehydratisierung hinzugefügt, um weitere zu vermeiden Schrumpfung und Schwellung der Zellen 3. Die Dehydratisierung Schritt beim Einbetten kann auf Eis durchgeführt werden, um RNase-Aktivität bei gering zu halten. In der P. abies Protokoll der 4% Paraformaldehyd fix Lösung enthält 0,25% Glutaraldehyd, die angeblich ein besseres RNA Zurückbehaltungsrecht 17 Auch wenn einige, dass es wahrscheinlich keinen Unterschied 3 argumentieren ist. Nach dem Anschneiden des Materials wird auf Objektträgern fixiert und vorbehandelt (zB entwachst, rehydriert, permeabilisiert, behandelt, um unspezifische Bindung der Sonde und schließlich dehydriert zu reduzieren), bevor die Hybridisierung. In das Protokoll hier präsentierten die gesamte Verfahren des Nachweises in normalen Labors durchgeführt werden kann, entwickelt sich das Signal in der Regel innerhalb von 1-3 Tagen und das Verhältnis zwischen Signal über Hintergrund können kontinuierlich überwacht werden. Die DIG-markierten Sonden in der Regel geben ein deutlicheres Signal als zu radioaktiv markierten Sonden sind im Vergleich viel stabiler und kann in nachfolgenden Experimenten verwendet werden. Auf der anderen Seite ist die Empfindlichkeit gegenüber radioaktiven Sonden 17 reduziert. In-situ-Hybridisierung detektiert Ausdruck mit einer markierten Sonde spezifisch für eine bestimmte mRNA. Radio-Kennzeichnung ist eine robuste und empfindliche Kennzeichnung Methode, aber es erfordert Umgang mit Radioaktivität und es dauert mehrere Wochen, bevor die Ergebnisse nachgewiesen werden können. Antigen-markierten Sonden auf der anderen Seite, sind stabiler, weniger gefährliche und erfordern Exposition gegenüber den Nachweis Medium für ein paar Tage nur 17. So sind Antigen-Kennzeichnung Methoden derzeit dominieren. Der wichtigste Schritt unabhängig vom Protokoll wird die Sonde Design. Es ist darauf zu machen, dass die Sonde hat eine hohe Spezifität und ist mit hochwertigen UTPs gekennzeichnet werden. Manchmal ist die Hybridisierung Temperatur und / oder Reaktion Länge haben, um für spezifische Sonden eingestellt werden. Unsere modifizierte Protokoll auf DIG-markierten Sonden basieren, Lokalisierung von mRNA-Expression gleichzeitig erleichtern Arten von A. thaliana zu P. abies sollte und mit geringfügigen Anpassungen nutzbar sein in anderen Pflanzenarten. Das Protokoll hat neben männlichen Zapfen, auch auf unterschiedlichen Stufen der vegetativen Triebe und in beiden zygotischen und somatische Embryonen aus P. getestet abies mit guten Ergebnissen (unveröffentlichte Ergebnisse;. Karlgren et al).

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Acetic anhydride</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>A6404-200ml</td>
<td>minimum 98%</td>
</tr>
<tr>
<td>Acrylamide, linear</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Ambion</td>
<td>9520</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Anti-DIG-antibodies</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roche Applied Science</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Blocking reagent</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roche Applied Science</td>
<td>11 175 041 910 or 11 096 176 001</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Bovine serum albumin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>A7030-50g</td>
<td>minimum 98%</td>
</tr>
<tr>
<td>Deionized formamide</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Denhardts solution</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>D2532-5ml</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>DEPC, diethylpyrocarbonate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dextran sulfate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>DIG RNA Labeling Kit (SP6/T7)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roche Applied Science</td>
<td>11175025910</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Glutaraldehyde (25%)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Histolab products AB</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Glycogen</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Ambion</td>
<td>9510G</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Histoclear II</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Histolab products AB</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>You may use Tissue-clear, Histoclear II, xylen or something similar when embedding your tissue.</td>
</tr>
<tr>
<td>Histowax</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Histolab products AB</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Histowax or Paraplast can be used for embedding.</td>
</tr>
<tr>
<td>Paraformaldehyde</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>P6148-500g</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Paraplast plus</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>P3683-1kg</td>
<td>Histowax or Paraplast can be used for embedding.</td>
</tr>
<tr>
<td>Phusion&#x2122; High-Fidility DNA Polymerase</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Finnzymes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Probe-on Plus slides</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fischer Scientific</td>
<td>22-230-900</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Proteinase K</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>P2308-5mg</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>RNase A</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>R5503-100mg</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Tissue-clear</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sakura Finetek Europ&#233; BV</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>You may use Tissue-clear, Histoclear II, xylen or something similar when embedding your tissue.</td>
</tr>
<tr>
<td>Triethanolamine</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>T1377-100ml</td>
<td>minimum 98%</td>
</tr>
<tr>
<td>Triton X-100</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>use your standard product in the lab</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Use one or both of Triton X-100 and Tween-20.</td>
</tr>
<tr>
<td>tRNA</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>83853-100mg</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Tween-20</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>use your standard product in the lab</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Use one or both of Triton X-100 and Tween-20.</td>
</tr>
<tr>
<td>Western Blue</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Promega Corp.</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

non-radioactive in situ hybridization protocol applicable for norway spruce and a range of plant species

Die High-Throughput-Expressions-Analyse heute verfügbaren Technologien können Wissenschaftler einen Überlauf des Ausdrucks-Profilen, sondern ihre Auflösung in Bezug auf die gewebespezifische Expression ist aufgrund von Problemen in seziert einzelne Gewebe beschränkt. Expression Daten müssen bestätigt und ergänzt mit Expressionsmuster zB mit in-situ-Hybridisierung, eine Technik zur Lokalisierung zellspezifische mRNA-Expression. Die in-situ-Hybridisierung Methode ist mühsam, zeitaufwendig und erfordert oft umfangreiche Optimierung je nach Art und Gewebe. In situ Experimente sind relativ schwer zu holzigen Arten wie der Nadelbaum Fichte (Picea abies) durchzuführen. Hier präsentieren wir eine modifizierte DIG in-situ-Hybridisierung-Protokoll, das eine schnelle und anwendbar auf eine Vielzahl von Pflanzenarten, darunter P. ist abies. Mit nur wenigen Anpassungen, einschließlich verändertem RNase-Behandlung und Proteinase K-Konzentration, könnten wir das Protokoll gewebespezifische Expression von homologen Gene in männlichen Geschlechtsorgane eines Gymnospermen und zwei Angiospermen Arten zu studieren; P. abies, Arabidopsis thaliana und Brassica napus. Das Protokoll arbeitet gleichermaßen gut für die Arten und Gene untersucht. AtAP3 und BnAP3 wurden in der zweiten und dritten Wirtel Blütenorgane in A. beobachtet thaliana und B. napus und DAL13 in microsporophylls der männlichen Zapfen von P. abies. Für P. abies die Proteinase K-Konzentration verwendet, um das Gewebe permeablize, musste auf 3 erhöht werden g / ml statt 1 g / ml, möglicherweise aufgrund einer kompakteren Gewebe und höhere Phenole und Polysaccharide. Für alle Arten der RNase-Behandlung wurde aufgrund der reduzierten Signalstärke ohne eine entsprechende Erhöhung der Spezifität entfernt. Durch den Vergleich gewebespezifische Expressionsmuster von homologen Gene von beiden Blütenpflanzen und ein Nadelbaum wir zeigen, dass die DIG in situ-Protokoll hier vorgestellt, mit nur minimale Anpassungen, kann auf ein breites Spektrum von Pflanzenarten angewendet werden. Daher vermeidet das Protokoll sowohl umfassende artspezifischen Optimierung und die mühsame Verwendung von radioaktiv markierten Sonden zu Gunsten der DIG-markierten Sonden. Wir haben uns entschieden, die technisch anspruchsvolle Schritte des Protokolls in unserem Film zu veranschaulichen. Anna Karlgren und Jenny Carlsson trugen gleichermaßen zu dieser Studie. Entsprechende Autoren: Anna Karlgren bei Anna.Karlgren @ ebc.uu.se und Jens F. Sundström bei Jens.Sundstrom @ vbsg.slu.se

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Non-radioactive in situ Hybridization Protocol Applicable for Norway Spruce and a Range of Plant Species

Wir beschreiben ein modifiziertes DIG<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisierung Protokoll, das eine schnelle und anwendbar auf eine Vielzahl von Pflanzenarten, darunter Fichte ist. Mit nur wenigen Anpassungen, einschließlich verändertem RNase-Behandlung und Proteinase K-Konzentration kann das Protokoll in Studien von verschiedenen Geweben und Spezies verwendet werden.

Nicht radioaktiv In situ Hybridisierung Protocol Einsetzbar für Fichte und einer Reihe von Pflanzenarten

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