Name: non-radioactive in situ hybridization protocol applicable for norway spruce and a range of plant species
Uploaded: 2009-04-17T00:00:00
Duration: 11 min 56 s
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Siamo molto grati a Anders Bovin che ha fornito la musica per il nostro cinema e di Michael Elliot Azioni per il volontariato di essere la voce degli altoparlanti. Il sostegno è stato fornito da Carl Trygger Foundation, il programma di ricerca strategica Genomica Funzionale agricola (AgriFunGen) presso l&#39;Università svedese di Scienze Agrarie, il Consiglio svedese della ricerca (VR), e il Consiglio svedese della ricerca per l&#39;ambiente, Scienze Agrarie, e della pianificazione territoriale (FORMAS ).

<ol>
	<li>Carr, S. M., Irish, V. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Floral+homeotic+gene+expression+defines+developmental+arrest+stages+in+Brassica+oleracea+L.+vars.+botrytis+and+italica.">Floral homeotic gene expression defines developmental arrest stages in Brassica oleracea L. vars. botrytis and italica.</a> Planta. 201 (2), 179-188 (1997).</li><li>Coen, E. S., Meyerowitz, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+war+of+the+whorls:+genetic+interactions+controlling+flower+development.">The war of the whorls: genetic interactions controlling flower development.</a> Nature. 353 (6339), 31-37 (1991).</li><li>Jackson, D., Gurr, S. J., McPherson, M. J., Bowles, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+hybridization+in+plants.">In situ hybridization in plants.</a> Molecular Plant Patology: a practical approach. , (1991).</li><li>Leitch, A. R., Schwarzacher, T., Jackson, D., Leitch, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> In situ hybridization: a practical guide. , (1994).</li><li>Smyth, D. R., Bowman, J. L., Meyerowitz, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+flower+development+in+Arabidopsis.">Early flower development in Arabidopsis.</a> Plant Cell. 2 (8), 755-767 (1990).</li><li>Azevedo, H., Lino-Neto, T., Tavares, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+method+for+high-quality+RNA+isolation+from+needles+of+adult+maritime+pine+trees.">An improved method for high-quality RNA isolation from needles of adult maritime pine trees.</a> Plant Molecular Biology Reporter. , 333-338 (2003).</li><li>Sundstrom, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MADS-box+genes+active+in+developing+pollen+cones+of+Norway+spruce+(Picea+abies)+are+homologous+to+the+B-class+floral+homeotic+genes+in+angiosperms.">MADS-box genes active in developing pollen cones of Norway spruce (Picea abies) are homologous to the B-class floral homeotic genes in angiosperms.</a> Dev Genet. 25 (3), 253-266 (1999).</li><li>Tandre, K., Svenson, M., Svensson, M. E., Engstrom, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conservation+of+gene+structure+and+activity+in+the+regulation+of+reproductive+organ+development+of+conifers+and+angiosperms.">Conservation of gene structure and activity in the regulation of reproductive organ development of conifers and angiosperms.</a> Plant J. 15 (5), 615-623 (1998).</li><li>Winter, K. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MADS-box+genes+reveal+that+gnetophytes+are+more+closely+related+to+conifers+than+to+flowering+plants.">MADS-box genes reveal that gnetophytes are more closely related to conifers than to flowering plants.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (13), 7342-7347 (1999).</li><li>Savard, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chloroplast+and+nuclear+gene+sequences+indicate+late+Pennsylvanian+time+for+the+last+common+ancestor+of+extant+seed+plants.">Chloroplast and nuclear gene sequences indicate late Pennsylvanian time for the last common ancestor of extant seed plants.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 91 (11), 5163-5167 (1994).</li><li>Jack, T., Brockman, L. L., Meyerowitz, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+homeotic+gene+APETALA3+of+Arabidopsis+thaliana+encodes+a+MADS+box+and+is+expressed+in+petals+and+stamens.">The homeotic gene APETALA3 of Arabidopsis thaliana encodes a MADS box and is expressed in petals and stamens.</a> Cell. 68 (4), 683-697 (1992).</li><li>Bowman, J. L., Smyth, D. R., Meyerowitz, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genes+directing+flower+development+in+Arabidopsis.">Genes directing flower development in Arabidopsis.</a> Plant Cell. 1 (1), 37-52 (1989).</li><li>Kramer, E. M., Irish, V. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+genetic+mechanisms+controlling+petal+development.">Evolution of genetic mechanisms controlling petal development.</a> Nature. 399 (6732), 144-148 (1999).</li><li>Sundstrom, J., Engstrom, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conifer+reproductive+development+involves+B-type+MADS-box+genes+with+distinct+and+different+activities+in+male+organ+primordia.">Conifer reproductive development involves B-type MADS-box genes with distinct and different activities in male organ primordia.</a> Plant J. 31 (2), 161-169 (2002).</li><li>Carlsson, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microarray+analysis+reveals+altered+expression+of+a+large+number+of+nuclear+genes+in+developing+cytoplasmic+male+sterile+Brassica+napus+flowers.">Microarray analysis reveals altered expression of a large number of nuclear genes in developing cytoplasmic male sterile Brassica napus flowers.</a> Plant J. 49 (3), 452-462 (2007).</li><li>Teixeira, R. T., Farbos, I., Glimelius, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+levels+of+meristem+identity+and+homeotic+genes+are+modified+by+nuclear-mitochondrial+interactions+in+alloplasmic+male-sterile+lines+of+Brassica+napus.">Expression levels of meristem identity and homeotic genes are modified by nuclear-mitochondrial interactions in alloplasmic male-sterile lines of Brassica napus.</a> Plant J. 42 (5), 731-742 (2005).</li><li>Ying, S., Kay, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+technique+of+in+situ+hybridization.">The technique of in situ hybridization.</a> Methods in Molecular Medicine. 56, 263-283 (2001).</li></ol>

Due aspetti del P. abies protocollo sono stati ottimizzati rispetto alla A. thaliana / B. napus protocollo, RNasi trattamento e proteinasi K concentrazione. La RNAsi rimuove i segnali di fondo e quindi aumenta la specificità del segnale 17. Il trattamento proteinasi K è necessaria per permeabilize tessuti modo che la sonda può entrare e ibridare alla piscina RNA di interesse. Il DAL13 antisenso sonda ha dato un segnale superiore senza RNasi-trattamento (Fig. 3C, E, G), rispetto a sezioni trattate con RNasi per 30 min (Figura 2D, F e H). Dato che la RNAsi-trattamento non ha incrementato il segnale è stato rimosso dal protocollo. Il trattamento proteinasi K sono stati testati a tre diverse concentrazioni, 1, 3 e 5 mg / ml. Nel caso di P. abies un segnale basso o nullo è stato osservato con 1 mg / ml di proteinasi K (Fig. 3C-D). Un segnale forte è stato ottenuto sia con 3 g / ml (Fig. 3E-F) e 5 mg / ml (Fig. 3G-H) proteinasi K. Poiché nessuna differenza apparente nella potenza del segnale è stato trovato quando con 5 mg / ml di proteinasi K rispetto a 3 mg / ml, abbiamo scelto di utilizzare 3 mg / ml nel nostro protocollo. E &#39;probabile che la necessità di una concentrazione più alta proteinasi K in P. abies coni maschio rispetto alla A. thaliana e B. napus gemme floreali è dovuto al tessuto più compatto, con livelli più elevati di composti fenolici e polisaccaridi. Durante la fissazione e di inclusione delle differenze tra la A. thaliana / B. napus protocollo e la P. abies protocollo sono evidenti. Il tessuto di interesse è fissato per fornire ritenzione RNA e questo è un passo fondamentale in quanto materiali poco fisso potrebbe dare un segnale basso o non rilevabili, anche se l&#39;mRNA è molto abbondante. Il tessuto è disidratato, cancellato e incorporati in cera a cambiamenti graduali per evitare danni ai tessuti, e in alcuni protocolli di NaCl 0,85% viene aggiunto l&#39;etanolo nella disidratazione per evitare ulteriori ritiro e rigonfiamento delle cellule 3. Il passo disidratazione durante embedding possono essere eseguite su ghiaccio per mantenere l&#39;attività RNAsi al minimo. Nel P. abies protocollo la soluzione al 4% paraformaldeide fix contiene 0,25% glutaraldeide, che dovrebbe dare una migliore ritenzione RNA 17, anche se alcuni sostengono che probabilmente non fa differenza 3. Dopo sezionare il materiale è fissato su diapositive e pretrattati (cioè deparaffinati, reidratato, permeabilizzate, trattato per ridurre legame non specifico della sonda e, infine, disidratati) prima della ibridazione. Nel protocollo presentato qui la procedura di rilevamento intero può essere eseguita nei laboratori ordinari, il segnale di solito si sviluppa entro 1-3 giorni e il rapporto tra il segnale su sfondo può essere continuamente monitorato. Il DIG-sonde marcate di solito danno un segnale più distinti rispetto ai radioattivo sonde marcate, sono più stabili e possono essere riutilizzati in esperimenti consecutivi. D&#39;altra parte, la sensibilità è ridotta rispetto alle sonde radioattive 17. Ibridazione in situ rileva espressione utilizzando una sonda marcata specifica per un determinato mRNA. Radio-etichettatura è un metodo di etichettatura affidabile e sensibile, ma richiede una gestione della radioattività e ci vogliono diverse settimane prima che i risultati possono essere rilevati. Antigene-sonde marcate invece, sono più stabili, meno pericolosi e richiedono l&#39;esposizione al mezzo di rilevazione per pochi giorni solo 17. Così, antigene-etichettatura metodi sono attualmente dominante. La fase più critica a prescindere dal protocollo è il design della sonda. Si deve prestare attenzione per assicurarsi che la sonda ha una alta specificità ed è etichettata con UTPs di alta qualità. A volte l&#39;ibridazione di temperatura e / o la lunghezza di reazione devono essere adattati per sonde specifiche. Il nostro protocollo modificato sulla base di DIG-sonde marcate faciliterà la localizzazione di espressione di mRNA contemporaneamente in specie che vanno da A. thaliana a P. abies, e con piccole modifiche dovrebbero essere utilizzabili in altre specie di piante. Il protocollo ha, accanto coni maschili, anche stato testato su diverse fasi di germogli vegetativi e in entrambi i zigotico embrioni somatici e da P. abies con buoni risultati (risultati non pubblicati;. Karlgren et al).

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Acetic anhydride</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>A6404-200ml</td>
<td>minimum 98%</td>
</tr>
<tr>
<td>Acrylamide, linear</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Ambion</td>
<td>9520</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Anti-DIG-antibodies</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roche Applied Science</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Blocking reagent</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roche Applied Science</td>
<td>11 175 041 910 or 11 096 176 001</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Bovine serum albumin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>A7030-50g</td>
<td>minimum 98%</td>
</tr>
<tr>
<td>Deionized formamide</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Denhardts solution</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>D2532-5ml</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>DEPC, diethylpyrocarbonate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dextran sulfate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>DIG RNA Labeling Kit (SP6/T7)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roche Applied Science</td>
<td>11175025910</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Glutaraldehyde (25%)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Histolab products AB</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Glycogen</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Ambion</td>
<td>9510G</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Histoclear II</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Histolab products AB</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>You may use Tissue-clear, Histoclear II, xylen or something similar when embedding your tissue.</td>
</tr>
<tr>
<td>Histowax</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Histolab products AB</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Histowax or Paraplast can be used for embedding.</td>
</tr>
<tr>
<td>Paraformaldehyde</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>P6148-500g</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Paraplast plus</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>P3683-1kg</td>
<td>Histowax or Paraplast can be used for embedding.</td>
</tr>
<tr>
<td>Phusion&#x2122; High-Fidility DNA Polymerase</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Finnzymes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Probe-on Plus slides</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fischer Scientific</td>
<td>22-230-900</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Proteinase K</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>P2308-5mg</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>RNase A</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>R5503-100mg</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Tissue-clear</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sakura Finetek Europ&#233; BV</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>You may use Tissue-clear, Histoclear II, xylen or something similar when embedding your tissue.</td>
</tr>
<tr>
<td>Triethanolamine</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>T1377-100ml</td>
<td>minimum 98%</td>
</tr>
<tr>
<td>Triton X-100</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>use your standard product in the lab</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Use one or both of Triton X-100 and Tween-20.</td>
</tr>
<tr>
<td>tRNA</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>83853-100mg</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Tween-20</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>use your standard product in the lab</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Use one or both of Triton X-100 and Tween-20.</td>
</tr>
<tr>
<td>Western Blue</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Promega Corp.</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

non-radioactive in situ hybridization protocol applicable for norway spruce and a range of plant species

Le tecnologie high-throughput analisi di espressione oggi disponibili agli scienziati un overflow dei profili di espressione, ma la loro risoluzione in termini di espressione tessuto specifica è limitato a causa di problemi nella dissezione dei tessuti individuali. Dati di espressione deve essere confermata e integrata con i modelli di espressione utilizzando ad esempio di ibridazione in situ, una tecnica utilizzata per localizzare cellula specifica espressione di mRNA. Il metodo di ibridazione in situ è faticoso, richiede tempo e spesso richiede l&#39;ottimizzazione estese a seconda della specie e dei tessuti. Negli esperimenti in situ sono relativamente più difficili da eseguire in specie legnose come la Norvegia conifere abete rosso (Picea abies). Qui vi presentiamo una DIG modificato nel protocollo ibridazione in situ, che è veloce e applicabile su una vasta gamma di specie vegetali tra cui P. abies. Con solo alcuni aggiustamenti, tra cui alterato RNasi trattamento e la concentrazione proteinasi K, si potrebbe utilizzare il protocollo per lo studio dell&#39;espressione tessuto specifica di geni omologhi in organi riproduttivi maschili di una gimnosperme e due specie di angiosperme; P. abies, Arabidopsis thaliana e Brassica napus. Il protocollo ha lavorato altrettanto bene per la specie e geni studiati. AtAP3 e BnAP3 sono state osservate negli organi spirale secondo e terzo floreali in A. thaliana e B. napus e DAL13 in microsporophylls di coni maschio da P. abies. Per P. abies la concentrazione proteinasi K, usato per permeablize i tessuti, doveva essere aumentata a 3 g / ml invece di 1 g / ml, forse a causa di tessuti più compatti e più elevati livelli di composti fenolici e polisaccaridi. Per tutte le specie il trattamento RNAsi è stato rimosso a causa della ridotta potenza del segnale senza un corrispondente aumento della specificità. Confrontando pattern di espressione di specifici tessuti omologhi geni di entrambi piante da fiore e un albero di conifere dimostriamo che il DIG in situ protocollo presentato qui, con solo piccoli aggiustamenti, può essere applicato a una vasta gamma di specie vegetali. Quindi, il protocollo evita sia l&#39;ottimizzazione vasta specie specifico e l&#39;uso di sonde laborioso radioattivo a favore di sonde DIG etichettati. Abbiamo scelto di illustrare i passaggi tecnicamente impegnativo del protocollo nel nostro film. Anna Karlgren e Jenny Carlsson contribuito in maniera uguale a questo studio. Autori corrispondenti: Anna Karlgren a Anna.Karlgren @ ebc.uu.se e Jens Sundström F. a Jens.Sundstrom @ vbsg.slu.se

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Non-radioactive in situ Hybridization Protocol Applicable for Norway Spruce and a Range of Plant Species

Descriviamo un DIG modificato<em&gt; In situ</em&gt; Protocollo di ibridazione, che è veloce e applicabile su una vasta gamma di specie vegetali tra cui la Norvegia abete rosso. Con solo alcuni aggiustamenti, tra cui alterato RNasi trattamento e la concentrazione proteinasi K, il protocollo può essere utilizzato negli studi di diversi tessuti e specie.

Non radioattivo In situ Protocollo di ibridazione applicabile per la Norvegia Abete e una serie di specie di piante

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