Name: non-radioactive in situ hybridization protocol applicable for norway spruce and a range of plant species
Uploaded: 2009-04-17T00:00:00
Duration: 11 min 56 s
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我々は、スピーカーの音声になるボランティアのための私達の映画の音楽を提供し、マイケルエリオットの株式にアンダースBovinに非常に感謝しています。サポートがカールTrygger財団、農業科学、スウェーデン研究評議会（VR）のスウェーデンの大学戦略的研究プログラム農業ゲノム機能（AgriFunGen）、および環境のためのスウェーデンの研究評議会、農業科学、及び空間計画（FORMASによって提供されていました）。

<ol>
	<li>Carr, S. M., Irish, V. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Floral+homeotic+gene+expression+defines+developmental+arrest+stages+in+Brassica+oleracea+L.+vars.+botrytis+and+italica.">Floral homeotic gene expression defines developmental arrest stages in Brassica oleracea L. vars. botrytis and italica.</a> Planta. 201 (2), 179-188 (1997).</li><li>Coen, E. S., Meyerowitz, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+war+of+the+whorls:+genetic+interactions+controlling+flower+development.">The war of the whorls: genetic interactions controlling flower development.</a> Nature. 353 (6339), 31-37 (1991).</li><li>Jackson, D., Gurr, S. J., McPherson, M. J., Bowles, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+hybridization+in+plants.">In situ hybridization in plants.</a> Molecular Plant Patology: a practical approach. , (1991).</li><li>Leitch, A. R., Schwarzacher, T., Jackson, D., Leitch, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> In situ hybridization: a practical guide. , (1994).</li><li>Smyth, D. R., Bowman, J. L., Meyerowitz, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+flower+development+in+Arabidopsis.">Early flower development in Arabidopsis.</a> Plant Cell. 2 (8), 755-767 (1990).</li><li>Azevedo, H., Lino-Neto, T., Tavares, R. 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M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+homeotic+gene+APETALA3+of+Arabidopsis+thaliana+encodes+a+MADS+box+and+is+expressed+in+petals+and+stamens.">The homeotic gene APETALA3 of Arabidopsis thaliana encodes a MADS box and is expressed in petals and stamens.</a> Cell. 68 (4), 683-697 (1992).</li><li>Bowman, J. L., Smyth, D. R., Meyerowitz, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genes+directing+flower+development+in+Arabidopsis.">Genes directing flower development in Arabidopsis.</a> Plant Cell. 1 (1), 37-52 (1989).</li><li>Kramer, E. M., Irish, V. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+genetic+mechanisms+controlling+petal+development.">Evolution of genetic mechanisms controlling petal development.</a> Nature. 399 (6732), 144-148 (1999).</li><li>Sundstrom, J., Engstrom, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conifer+reproductive+development+involves+B-type+MADS-box+genes+with+distinct+and+different+activities+in+male+organ+primordia.">Conifer reproductive development involves B-type MADS-box genes with distinct and different activities in male organ primordia.</a> Plant J. 31 (2), 161-169 (2002).</li><li>Carlsson, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microarray+analysis+reveals+altered+expression+of+a+large+number+of+nuclear+genes+in+developing+cytoplasmic+male+sterile+Brassica+napus+flowers.">Microarray analysis reveals altered expression of a large number of nuclear genes in developing cytoplasmic male sterile Brassica napus flowers.</a> Plant J. 49 (3), 452-462 (2007).</li><li>Teixeira, R. T., Farbos, I., Glimelius, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+levels+of+meristem+identity+and+homeotic+genes+are+modified+by+nuclear-mitochondrial+interactions+in+alloplasmic+male-sterile+lines+of+Brassica+napus.">Expression levels of meristem identity and homeotic genes are modified by nuclear-mitochondrial interactions in alloplasmic male-sterile lines of Brassica napus.</a> Plant J. 42 (5), 731-742 (2005).</li><li>Ying, S., Kay, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+technique+of+in+situ+hybridization.">The technique of in situ hybridization.</a> Methods in Molecular Medicine. 56, 263-283 (2001).</li></ol>

著者らは、開示することは何もない。

Pの二つの側面トドマツプロトコルはAに比較して最適化されたシロイヌナズナ/ B.セイヨウプロトコル、RNase A処理およびプロテイナーゼKの濃度。 RNaseはバックグラウンド信号を除去し、従って信号の特異性を17増加させる。プロテイナーゼK処理、プローブが入ると興味のRNAのプールにハイブリダイズすることができるように組織を透過するために必要です。 DAL13アンチセンスプローブは、30分（図2D、FおよびH）のためにRNaseで処理のセクションに比べてのRNase処理（図3C、E、G）なしで高いシグナルを与えた。以来のRNase治療は、それがプロトコルから削除された信号を増強しなかった。 1、3および5μg/ mlを、プロテイナーゼK処理は、3つの異なる濃度で試験した。 P.の場合トドマツ 、低または無信号が1μg/ mlのプロテイナーゼK（図3C - D）を用いて観察された。 5μg/ mlのプロテ​​イナーゼKを使用する場合は信号強度に明らかな差が見られなかったので、強い信号は、3μg/ mlの（図3E - F）、5μg/ mlの（図3G - H）プロテイナーゼKの両方が得られた3μg/ mlのに比べて、我々は我々のプロトコルの3μg/ mlを使用することにしました。 P.の高いプロテイナーゼKの濃度の必要可能性が高いですトドマツ男性の円錐Aに比べシロイヌナズナとB.セイヨウ花芽は、フェノール類および多糖類の高いレベルでよりコンパクトな組織によるものです。 固定時のとA.いくつかの違いを埋め込 ​​むシロイヌナズナ/ B.セイヨウプロトコルとP.トドマツプロトコルは明白です。興味の組織はRNAの保持を提供するために固定されており、不十分な固定材料はmRNAが非常に豊富であるにもかかわらず、低いか検出できないシグナルを与えるかもしれないので、これは重要なステップです。組織は、クリアと組織の損傷を避けるために、漸進的な変化のワックスに埋め込 ​​まれ、脱水され、そしていくつかのプロトコル0.85パーセントNaClにさらにセル3の収縮や腫れを防ぐために脱水エタノールに追加されます。埋め込み時の脱水工程は、最低でRNase活性を保つために氷の上で行うことができます。 P.でトドマツプロトコル4％パラホルムアルデヒド固定ソリューションは、いくつかはそれはおそらく何の違い3をなさないと主張それにもかかわらず、優れたRNAを保持する17を与えることになっている0.25％のグルタルアルデヒドを、含まれています。材料を切削後、ハイブリダイゼーションの前に（すなわち、脱蝋再水和し、透過処理、プローブの非特異的結合を減らすために治療し、最後に脱水）スライド上に固定し、前処理されています。 全体の検出手順ここで紹介するプロトコルで、通常の実験室で行うことができる、信号は1〜3日以内に通常の開発と背景上の信号と​​の比率を継続的に監視することができます。 DIG標識プローブは、通常、放射性標識プローブに比べて、より明確なシグナルを与える、より安定しており、連続した実験で再利用することができます。一方、感度は放射性プローブ17に比べて低減されます。situハイブリダイゼーションでは 、特定のmRNAに特異的な標識プローブを使用して式を検出する。ラジオ標識は、堅牢かつ高感度標識法ですが、それは放射能の処理を必要とし、その結果が検出される前にそれは数週間かかる。一方、抗原-標識プローブは、有害性の低い、より安定しており、わずか17数日間検出媒体への露出を必要とする。従って、抗原標識方法は、現在支配している。プロトコルに関係なく最も重要なステップは、プローブの設計です。ケアは、プローブは高い特異性を持ち、高品質のUTPsで標識されていることを確認する注意が必要です。時にはハイブリダイゼーション温度および/または反応の長さは、特定のプローブに調整する必要があります。 DIG標識プローブに基づいて私たちの修正されたプロトコルは、A.に至るまで種で同時にmRNA発現の局在を容易にするP.のシロイヌナズナトドマツ 、およびマイナーの調整で他の植物種で利用できるようになるはずです。プロトコルは、男性のコーンの横に、また植物シュートのさまざまな段階でとPから接合子と体細胞胚の両方でテストされています良い結果（。。カールグレンら未発表結果）とモミ属 。

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Acetic anhydride</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>A6404-200ml</td>
<td>minimum 98%</td>
</tr>
<tr>
<td>Acrylamide, linear</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Ambion</td>
<td>9520</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Anti-DIG-antibodies</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roche Applied Science</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Blocking reagent</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roche Applied Science</td>
<td>11 175 041 910 or 11 096 176 001</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Bovine serum albumin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>A7030-50g</td>
<td>minimum 98%</td>
</tr>
<tr>
<td>Deionized formamide</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Denhardts solution</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>D2532-5ml</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>DEPC, diethylpyrocarbonate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dextran sulfate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>DIG RNA Labeling Kit (SP6/T7)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roche Applied Science</td>
<td>11175025910</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Glutaraldehyde (25%)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Histolab products AB</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Glycogen</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Ambion</td>
<td>9510G</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Histoclear II</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Histolab products AB</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>You may use Tissue-clear, Histoclear II, xylen or something similar when embedding your tissue.</td>
</tr>
<tr>
<td>Histowax</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Histolab products AB</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Histowax or Paraplast can be used for embedding.</td>
</tr>
<tr>
<td>Paraformaldehyde</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>P6148-500g</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Paraplast plus</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>P3683-1kg</td>
<td>Histowax or Paraplast can be used for embedding.</td>
</tr>
<tr>
<td>Phusion&#x2122; High-Fidility DNA Polymerase</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Finnzymes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Probe-on Plus slides</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fischer Scientific</td>
<td>22-230-900</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Proteinase K</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>P2308-5mg</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>RNase A</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>R5503-100mg</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Tissue-clear</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sakura Finetek Europ&#233; BV</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>You may use Tissue-clear, Histoclear II, xylen or something similar when embedding your tissue.</td>
</tr>
<tr>
<td>Triethanolamine</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>T1377-100ml</td>
<td>minimum 98%</td>
</tr>
<tr>
<td>Triton X-100</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>use your standard product in the lab</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Use one or both of Triton X-100 and Tween-20.</td>
</tr>
<tr>
<td>tRNA</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>83853-100mg</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Tween-20</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>use your standard product in the lab</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Use one or both of Triton X-100 and Tween-20.</td>
</tr>
<tr>
<td>Western Blue</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Promega Corp.</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

non-radioactive in situ hybridization protocol applicable for norway spruce and a range of plant species

ハイスループット発現解析技術は、現在入手可能なので、個々の組織を解剖時の問題により制限されている科学者に発現プロファイルのオーバーフローが組織特異的発現の観点からその解決方法を与える。発現データは、in situハイブリダイゼーションなどを用いて発現パターンを確認し、補完する必要がある、するために使用される技術は、細胞特異的mRNAの発現をローカライズ。 in situハイブリダイゼーション法 、時間のかかる、面倒であり、しばしば種や組織に応じて大規模な最適化が必要です。 場の実験ではそのような針葉樹ノルウェートウヒ（ ドイツトウヒ ）などの木本種で実行することが比較的困難です。ここでは、P.を含む植物種の広い範囲で高速かつ適用可能なin situハイブリダイゼーションのプロトコールで修正されたDIGを、提示モミ属 。変更されたRNase処理とプロテイナーゼKの濃度を含むだけでいくつかの調整、と、我々一裸子植物二被子植物の種の雄の生殖器官の相同遺伝子の組織特異的発現を研究するためのプロトコルを使用することができます。P.トドマツ、シロイヌナズナとセイヨウアブラナ 。プロトコルは、研究の種との遺伝子にも同様に働いた。AtAP3とBnAP3がAにある2番目と3番目の渦巻き花器官で観察されたシロイヌナズナとB.セイヨウとP.から男性の円錐のmicrosporophyllsのDAL13 モミ属 。 Pの組織をpermeablizeするために使用されるプロテイナーゼKの濃度は、よりコンパクトな組織とフェノール類と多糖類のより高いレベルが原因の可能性ではなく、1〜3 g / mlのg / mlで、に増加する必要があったモミ属 。すべての種のためにRNase処理は、特異性の増加に対応することなく減少し、信号強度のために削除されました。草花や針葉樹の両方から相同遺伝子の組織特異的発現パターンを比較することによって我々は、 その場プロトコルの DIGだけ微調整して、ここで提示した実証は植物種の広い範囲に適用することができます。したがって、プロトコルは広範な生物種固有の最適化とDIG標識プローブを支持して放射性標識プローブの面倒な使用の両方を避けることができます。私たちは、映画におけるプロトコルの技術的な要求の手順を説明するために選択しました。 アンナカールグレンとジェニーカールソンはこの研究にも同様に貢献した。 対応する制作者：Jens.Sundstrom @ vbsg.slu.seでAnna.Karlgren @ ebc.uu.seとJens F.のSundströmでアンナカールグレン

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Non-radioactive in situ Hybridization Protocol Applicable for Norway Spruce and a Range of Plant Species

我々は、修正されたDIGを説明<em&gt;その場で</em高速とノルウェートウヒを含む植物種の広い範囲で適用できる&gt;のハイブリダイゼーションプロトコル、。変更されたRNase処理とプロテイナーゼKの濃度を含むだけでいくつかの調整、と、プロトコルは、さまざまな組織や種の研究に使用されることがあります。

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