Name: non-radioactive in situ hybridization protocol applicable for norway spruce and a range of plant species
Uploaded: 2009-04-17T00:00:00
Duration: 11 min 56 s
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우리는 스피커 음성으로 자원 봉사를위한 영화 음악을 제공 앤더스 보빈과 마이클 엘리엇 주식 매우 감사하고 있습니다. 지원 칼 Trygger 재단, 농업 과학, 스웨덴 연구 협의회 (VR)의 스웨덴의 대학에서 전략적 연구 프로그램 농업 기능성 유전체학 (AgriFunGen), 그리고 환경에 대한 스웨덴 연구 협의회, 농업 과학, 그리고 공간 계획 (FORMAS에 의해 제공된 ).

<ol>
	<li>Carr, S. M., Irish, V. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Floral+homeotic+gene+expression+defines+developmental+arrest+stages+in+Brassica+oleracea+L.+vars.+botrytis+and+italica.">Floral homeotic gene expression defines developmental arrest stages in Brassica oleracea L. vars. botrytis and italica.</a> Planta. 201 (2), 179-188 (1997).</li><li>Coen, E. S., Meyerowitz, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+war+of+the+whorls:+genetic+interactions+controlling+flower+development.">The war of the whorls: genetic interactions controlling flower development.</a> Nature. 353 (6339), 31-37 (1991).</li><li>Jackson, D., Gurr, S. J., McPherson, M. J., Bowles, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+hybridization+in+plants.">In situ hybridization in plants.</a> Molecular Plant Patology: a practical approach. , (1991).</li><li>Leitch, A. R., Schwarzacher, T., Jackson, D., Leitch, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> In situ hybridization: a practical guide. , (1994).</li><li>Smyth, D. R., Bowman, J. L., Meyerowitz, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+flower+development+in+Arabidopsis.">Early flower development in Arabidopsis.</a> Plant Cell. 2 (8), 755-767 (1990).</li><li>Azevedo, H., Lino-Neto, T., Tavares, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+method+for+high-quality+RNA+isolation+from+needles+of+adult+maritime+pine+trees.">An improved method for high-quality RNA isolation from needles of adult maritime pine trees.</a> Plant Molecular Biology Reporter. , 333-338 (2003).</li><li>Sundstrom, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MADS-box+genes+active+in+developing+pollen+cones+of+Norway+spruce+(Picea+abies)+are+homologous+to+the+B-class+floral+homeotic+genes+in+angiosperms.">MADS-box genes active in developing pollen cones of Norway spruce (Picea abies) are homologous to the B-class floral homeotic genes in angiosperms.</a> Dev Genet. 25 (3), 253-266 (1999).</li><li>Tandre, K., Svenson, M., Svensson, M. 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U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MADS-box+genes+reveal+that+gnetophytes+are+more+closely+related+to+conifers+than+to+flowering+plants.">MADS-box genes reveal that gnetophytes are more closely related to conifers than to flowering plants.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (13), 7342-7347 (1999).</li><li>Savard, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chloroplast+and+nuclear+gene+sequences+indicate+late+Pennsylvanian+time+for+the+last+common+ancestor+of+extant+seed+plants.">Chloroplast and nuclear gene sequences indicate late Pennsylvanian time for the last common ancestor of extant seed plants.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 91 (11), 5163-5167 (1994).</li><li>Jack, T., Brockman, L. L., Meyerowitz, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+homeotic+gene+APETALA3+of+Arabidopsis+thaliana+encodes+a+MADS+box+and+is+expressed+in+petals+and+stamens.">The homeotic gene APETALA3 of Arabidopsis thaliana encodes a MADS box and is expressed in petals and stamens.</a> Cell. 68 (4), 683-697 (1992).</li><li>Bowman, J. L., Smyth, D. R., Meyerowitz, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genes+directing+flower+development+in+Arabidopsis.">Genes directing flower development in Arabidopsis.</a> Plant Cell. 1 (1), 37-52 (1989).</li><li>Kramer, E. M., Irish, V. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+genetic+mechanisms+controlling+petal+development.">Evolution of genetic mechanisms controlling petal development.</a> Nature. 399 (6732), 144-148 (1999).</li><li>Sundstrom, J., Engstrom, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conifer+reproductive+development+involves+B-type+MADS-box+genes+with+distinct+and+different+activities+in+male+organ+primordia.">Conifer reproductive development involves B-type MADS-box genes with distinct and different activities in male organ primordia.</a> Plant J. 31 (2), 161-169 (2002).</li><li>Carlsson, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microarray+analysis+reveals+altered+expression+of+a+large+number+of+nuclear+genes+in+developing+cytoplasmic+male+sterile+Brassica+napus+flowers.">Microarray analysis reveals altered expression of a large number of nuclear genes in developing cytoplasmic male sterile Brassica napus flowers.</a> Plant J. 49 (3), 452-462 (2007).</li><li>Teixeira, R. T., Farbos, I., Glimelius, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+levels+of+meristem+identity+and+homeotic+genes+are+modified+by+nuclear-mitochondrial+interactions+in+alloplasmic+male-sterile+lines+of+Brassica+napus.">Expression levels of meristem identity and homeotic genes are modified by nuclear-mitochondrial interactions in alloplasmic male-sterile lines of Brassica napus.</a> Plant J. 42 (5), 731-742 (2005).</li><li>Ying, S., Kay, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+technique+of+in+situ+hybridization.">The technique of in situ hybridization.</a> Methods in Molecular Medicine. 56, 263-283 (2001).</li></ol>

P. 두 측면 아비 에스 프로토콜 A.에 비해 최적화되었습니다 thaliana / B. napus 프로토콜 RNase 처리 및 proteinase K의 농도. RNase 배경 신호를 제거하기 때문에 신호 특이성의 17 증가합니다. proteinase K 처리는 프로브 입력과 관심의 RNA 수영장에 잡종 수 있도록 조직을 permeabilize 필요합니다. DAL13 안티 센스 탐사선은 30 분 (그림 2D, F 및 H)의 RNase 취급 섹션에 비해 RNase - 치료 (그림 3C, E, G)없이 높은 신호를 주었다. RNase - 치료 신호를 강화하지 않았으므로 그것은 프로토콜에서 제거되었습니다. 1, 3 및 5 μg / ML, proteinase K 치료는 세 가지 다른 농도에서 테스트되었습니다. P.의 경우에는 낮은 또는 아니오 신호 아비 에스는 1 μg / ML proteinase K (그림 3C - D)를 사용하여 관찰되었다. 5 μg / ML proteinase K를 사용하면 강한 신호가 3 μg / ML (그림 3E - F), 5 μg / ML 모두 얻은 것입니다 (그림 3G - H) proteinase K.는 신호의 강도에 뚜렷한 차이가 있기 때문에 발견 3 μg / ML에 비해, 우리는 프로토콜 3 μg / ML을 사용하기로 결정했습니다. 그것은 가능성이 그 P.의 높은 proteinase K의 농도의 필요성 아비 에스 남성 원뿔은 A. 비교 thaliana와 B. napus 꽃 꽃봉오리는 phenolics와 다당류의 높은 수준과 더 컴팩트한 조직에 의한 것입니다. 고정 동안과 A. 사이의 차이를 삽입 thaliana / B. napus 프로토콜과 P. 아비 에스 프로토콜은 분명합니다. 관심의 조직은 RNA 보존을 제공하는 고정하고 제대로 고정 재료는 mRNA가 매우 풍부에도 불구하고 낮은 또는 탐지 신호를 줄 수 있으므로 이것은 중요한 단계입니다. 조직 취소 및 조직 손상을 방지하기 위해 점진적 변화의 왁스에 포함된, 건조하고, 어떤 프로토콜을 0.85 % NaCl에서 추가 전지 3 수축과 팽창을 피하기 위해 탈수의 에탄올에 추가됩니다. 퍼가기 동안 탈수 단계는 최소한 RNase 활동을 유지하기 위해 얼음을 수행할 수 있습니다. P. 년 아비 에스 프로토콜 4 % paraformaldehyde의 해결책 일부는 아마도 아무런 차이 3도하지 않습니다 주장되는 경우에도 더 나은 RNA 보존 17를 제공하도록되어 0.25 %의 글루 타 알데히드를 포함하고 있습니다. 자료를 sectioning 후 하이브리드화 이전 (비 특정 프로브의 결합 그리고 마침내 탈진을 줄이기 위해 치료 permeabilized rehydrated 즉 dewaxed,,,) 슬라이드에 고정하고 pretreated입니다. 여기에 제시된 프로토콜 전체 검색 절차가 일반적인 실험실에서 수행할 수, 신호 1-3 일 이내 개발 및 배경을 통해 신호 간의 비율을 지속적으로 모니터링할 수 있습니다. 디그 - 라벨이 프로브는 일반적으로 방사능 표시 프로브에 비해,보다 뚜렷한 신호를보다 안정되고 연속 실험에 활용할 수 있습니다. 반면에, 감도는 방사성 프로브 17에 비해 줄일 수있다. 원위치 하이브리드화에서는 특정 mRNA의 특정 라벨 프로브를 사용하여 표현을 감지합니다. 라디오 레이블은 강력하고 민감한 분류 방법입니다하지만 방사능의 처리가 필요하며 그 결과가 감지되기​​ 전에는 몇 주 정도 소요됩니다. 한편 항원 - 라벨 프로브는 덜 위험한,보다 안정되고 겨우 17 몇 일 동안 검색 매체 노출을 필요로합니다. 따라서 항원 라벨링 방법은 현재 지배하고 있습니다. 에 관계없이 프로토콜의 가장 중요한 단계는 프로브 디자인입니다. 케어는 탐사선이 높은 특이성을 가지고 있으며, 양질의 UTPs로 분류되어 있는지 확인하십시오로 이동해야합니다. 가끔 하이브리드화 온도 및 / 또는 반응 길이는 특정 프로브에 따라 조정해야합니다. 디그 - 라벨 프로브에 따라 우리 수정된 프로토콜 A. 이르기까지 종 동시에 mRNA의 표현의 지방화를 촉진합니다 P.로 thaliana 아비 에스, 그리고 약간의 조정 다른 식물 종을에서 사용할 수 있어야합니다. 프로토콜은 남성 콘 옆에도 식물 쏘고의 다른 단계와 P.부터 접합자의와 체세포 배아 모두에서 테스트되었습니다 좋은 결과 (.; Karlgren 외 미발표 결과)와 아비 에스.

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Acetic anhydride</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>A6404-200ml</td>
<td>minimum 98%</td>
</tr>
<tr>
<td>Acrylamide, linear</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Ambion</td>
<td>9520</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Anti-DIG-antibodies</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roche Applied Science</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Blocking reagent</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roche Applied Science</td>
<td>11 175 041 910 or 11 096 176 001</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Bovine serum albumin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>A7030-50g</td>
<td>minimum 98%</td>
</tr>
<tr>
<td>Deionized formamide</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Denhardts solution</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>D2532-5ml</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>DEPC, diethylpyrocarbonate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dextran sulfate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>DIG RNA Labeling Kit (SP6/T7)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roche Applied Science</td>
<td>11175025910</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Glutaraldehyde (25%)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Histolab products AB</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Glycogen</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Ambion</td>
<td>9510G</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Histoclear II</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Histolab products AB</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>You may use Tissue-clear, Histoclear II, xylen or something similar when embedding your tissue.</td>
</tr>
<tr>
<td>Histowax</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Histolab products AB</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Histowax or Paraplast can be used for embedding.</td>
</tr>
<tr>
<td>Paraformaldehyde</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>P6148-500g</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Paraplast plus</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>P3683-1kg</td>
<td>Histowax or Paraplast can be used for embedding.</td>
</tr>
<tr>
<td>Phusion&#x2122; High-Fidility DNA Polymerase</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Finnzymes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Probe-on Plus slides</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fischer Scientific</td>
<td>22-230-900</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Proteinase K</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>P2308-5mg</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>RNase A</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>R5503-100mg</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Tissue-clear</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sakura Finetek Europ&#233; BV</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>You may use Tissue-clear, Histoclear II, xylen or something similar when embedding your tissue.</td>
</tr>
<tr>
<td>Triethanolamine</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>T1377-100ml</td>
<td>minimum 98%</td>
</tr>
<tr>
<td>Triton X-100</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>use your standard product in the lab</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Use one or both of Triton X-100 and Tween-20.</td>
</tr>
<tr>
<td>tRNA</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>83853-100mg</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Tween-20</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>use your standard product in the lab</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Use one or both of Triton X-100 and Tween-20.</td>
</tr>
<tr>
<td>Western Blue</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Promega Corp.</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

non-radioactive in situ hybridization protocol applicable for norway spruce and a range of plant species

높은 처리량 표현 분석 기술을 사용할 수 있기 때문에 오늘날 각각의 조직을 해부에 문제가 제한됩니다 과학자에게 표현 프로필 오버플로하지만, 구체적인 조직 표현의 측면에서 그들의 해상도를 제공합니다. 표현 데이터 확인 및 세포 특정 mRNA 표현을 집중하기 위해 현장 하이브리드화, 사용 기술의 예를 사용하여 표현식 패턴을 구비해야합니다. 현장 하이브 리다이 제이션 방식으로이 힘드는, 시간이 많이 걸리는이며 종종 종과 조직에 따라 광범위한 최적화가 필요합니다. 원위치 실험에서 같은 침엽수 노르웨이 스프루스 (피세아 아비 에스)로 우디 수종으로 수행하기 위해 상대적으로 더 어렵습니다. 여기 P. 포함한 식물 종의 다양한에서 빠르게 적용 현장 하이브리드화 프로토콜에서 수정된 파고를 제시 아비 에스. 변경된 RNase 처리 및 proteinase K 농도를 포함한 몇 가지 조정을 통해, 우리는 동종 한 gymnosperm의 남성 생식 기관의 유전자 두 angiosperm 종의 조직 구체적인 표현을 연구하기 위해 프로토콜을 사용할 수 있습니다; P. 아비 에스, Arabidopsis thaliana와 Brassica napus. 프로토콜은 공부 종 및 유전자 동일하게하였습니다. AtAP3과 BnAP3가 A에서 두 번째 및 세 번째 윤생체 플로랄 장기에서 관찰되었다 thaliana와 B. P.에서 남성 원뿔의 microsporophylls에 napus와 DAL13 아비 에스. P. 들어 아비 에스의 조직을 permeablize하는 데 사용되는 proteinase K의 농도는, 3 증가야만 G / ML 대신 1 개 소형 조직 및 phenolics와 다당류의 높은 수준을 가능으로 인해 G / ML. 모든 종족에 대한 RNase 처리는 특이성에 해당 증가없이 감소 신호 강도로 인해 제거되었습니다. 꽃 식물과 구과를 맺는 나무 모두의 상동 유전자의 조직 구체적인 표현 패턴을 비교하여 우리가 현장 프로토콜의 파고는 분 조정, 여기를 제시 것을 보여주는 식물 종의 다양한 적용할 수 있습니다. 따라서 프로토콜은 광범위한 종 특정 최적화 및 발굴 분류 프로브에 찬성 radioactively 레이블 프로브의 힘드는 사용 모두를 방지합니다. 우리는 영화에있는 프로토콜의 기술적 요구하는 단계를 설명하기 위해 선택했습니다. 안나 Karlgren 제니 칼슨은이 연구에 동등하게 공헌했습니다. 해당 저자 : Jens.Sundstrom @ vbsg.slu.se에서 Anna.Karlgren @ ebc.uu.se와 젠스 F.의 Sundström에 안나 Karlgren

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Non-radioactive in situ Hybridization Protocol Applicable for Norway Spruce and a Range of Plant Species

우리는 수정된 발굴을 설명<em&gt; 현장에서</em신속하고 노르웨이 스프루스를 포함한 식물 종의 광범위한 적용됩니다&gt; 하이브리드화 프로토콜. 변경된 RNase 처리 및 proteinase K 농도를 포함한 몇 가지 조정을 통해 프로토콜은 서로 다른 조직과 종의 연구에 사용할 수 있습니다.

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