Name: non-radioactive in situ hybridization protocol applicable for norway spruce and a range of plant species
Uploaded: 2009-04-17T00:00:00
Duration: 11 min 56 s
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Estamos muito gratos a Anders Bovin que forneceu a música para o nosso filme e Stocks Michael Elliot para o voluntariado para ser a voz do altifalante. Apoio foi fornecido por Carl Trygger Foundation, o programa estratégico de pesquisa agrícola Genômica Funcional (AgriFunGen) da Universidade Sueca de Ciências Agrícolas, o sueco Research Council (VR), eo Conselho de Pesquisa sueco do Ambiente, Ciências Agrárias e do Ordenamento do Território (FORMAS ).

<ol>
	<li>Carr, S. M., Irish, V. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Floral+homeotic+gene+expression+defines+developmental+arrest+stages+in+Brassica+oleracea+L.+vars.+botrytis+and+italica.">Floral homeotic gene expression defines developmental arrest stages in Brassica oleracea L. vars. botrytis and italica.</a> Planta. 201 (2), 179-188 (1997).</li><li>Coen, E. S., Meyerowitz, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+war+of+the+whorls:+genetic+interactions+controlling+flower+development.">The war of the whorls: genetic interactions controlling flower development.</a> Nature. 353 (6339), 31-37 (1991).</li><li>Jackson, D., Gurr, S. J., McPherson, M. J., Bowles, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+hybridization+in+plants.">In situ hybridization in plants.</a> Molecular Plant Patology: a practical approach. , (1991).</li><li>Leitch, A. R., Schwarzacher, T., Jackson, D., Leitch, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> In situ hybridization: a practical guide. , (1994).</li><li>Smyth, D. R., Bowman, J. L., Meyerowitz, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+flower+development+in+Arabidopsis.">Early flower development in Arabidopsis.</a> Plant Cell. 2 (8), 755-767 (1990).</li><li>Azevedo, H., Lino-Neto, T., Tavares, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+method+for+high-quality+RNA+isolation+from+needles+of+adult+maritime+pine+trees.">An improved method for high-quality RNA isolation from needles of adult maritime pine trees.</a> Plant Molecular Biology Reporter. , 333-338 (2003).</li><li>Sundstrom, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MADS-box+genes+active+in+developing+pollen+cones+of+Norway+spruce+(Picea+abies)+are+homologous+to+the+B-class+floral+homeotic+genes+in+angiosperms.">MADS-box genes active in developing pollen cones of Norway spruce (Picea abies) are homologous to the B-class floral homeotic genes in angiosperms.</a> Dev Genet. 25 (3), 253-266 (1999).</li><li>Tandre, K., Svenson, M., Svensson, M. 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U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MADS-box+genes+reveal+that+gnetophytes+are+more+closely+related+to+conifers+than+to+flowering+plants.">MADS-box genes reveal that gnetophytes are more closely related to conifers than to flowering plants.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (13), 7342-7347 (1999).</li><li>Savard, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chloroplast+and+nuclear+gene+sequences+indicate+late+Pennsylvanian+time+for+the+last+common+ancestor+of+extant+seed+plants.">Chloroplast and nuclear gene sequences indicate late Pennsylvanian time for the last common ancestor of extant seed plants.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 91 (11), 5163-5167 (1994).</li><li>Jack, T., Brockman, L. L., Meyerowitz, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+homeotic+gene+APETALA3+of+Arabidopsis+thaliana+encodes+a+MADS+box+and+is+expressed+in+petals+and+stamens.">The homeotic gene APETALA3 of Arabidopsis thaliana encodes a MADS box and is expressed in petals and stamens.</a> Cell. 68 (4), 683-697 (1992).</li><li>Bowman, J. L., Smyth, D. R., Meyerowitz, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genes+directing+flower+development+in+Arabidopsis.">Genes directing flower development in Arabidopsis.</a> Plant Cell. 1 (1), 37-52 (1989).</li><li>Kramer, E. M., Irish, V. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+genetic+mechanisms+controlling+petal+development.">Evolution of genetic mechanisms controlling petal development.</a> Nature. 399 (6732), 144-148 (1999).</li><li>Sundstrom, J., Engstrom, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conifer+reproductive+development+involves+B-type+MADS-box+genes+with+distinct+and+different+activities+in+male+organ+primordia.">Conifer reproductive development involves B-type MADS-box genes with distinct and different activities in male organ primordia.</a> Plant J. 31 (2), 161-169 (2002).</li><li>Carlsson, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microarray+analysis+reveals+altered+expression+of+a+large+number+of+nuclear+genes+in+developing+cytoplasmic+male+sterile+Brassica+napus+flowers.">Microarray analysis reveals altered expression of a large number of nuclear genes in developing cytoplasmic male sterile Brassica napus flowers.</a> Plant J. 49 (3), 452-462 (2007).</li><li>Teixeira, R. T., Farbos, I., Glimelius, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+levels+of+meristem+identity+and+homeotic+genes+are+modified+by+nuclear-mitochondrial+interactions+in+alloplasmic+male-sterile+lines+of+Brassica+napus.">Expression levels of meristem identity and homeotic genes are modified by nuclear-mitochondrial interactions in alloplasmic male-sterile lines of Brassica napus.</a> Plant J. 42 (5), 731-742 (2005).</li><li>Ying, S., Kay, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+technique+of+in+situ+hybridization.">The technique of in situ hybridization.</a> Methods in Molecular Medicine. 56, 263-283 (2001).</li></ol>

Dois aspectos do P. abies protocolo foram otimizadas em relação ao A. thaliana / B. napus protocolo, RNase tratamento e proteinase K concentração. A RNase remove sinais de fundo e assim aumentar a especificidade do sinal 17. O tratamento proteinase K é necessária para permeabilizar o tecido para que a sonda pode entrar e hibridizar para a piscina RNA de interesse. A sonda antisense DAL13 deu um maior sinal sem RNase-tratamento (Fig. 3C, E, G) em comparação com seções tratadas com RNase por 30 min (Figura 2D, F e H). Desde a RNase-tratamento não melhorou o sinal que foi retirado do protocolo. O tratamento proteinase K foram testadas em três concentrações diferentes; 1, 3 e 5 mg / ml. No caso de P. abies um sinal de baixa ou nenhuma foi observada usando 1 mg / ml proteinase K (Fig. 3C-D). Um sinal forte foi obtida com ambos mg 3 / ml (Fig. 3E-F) e 5 mg / ml (Fig. 3G-H) proteinase K. Uma vez que não aparente diferença na força do sinal quando foi encontrado usando 5 mg / ml proteinase K em comparação com 3 mg / ml, optamos por utilizar 3 mg / ml em nosso protocolo. É provável que a necessidade de uma maior concentração proteinase K na P. abies cones masculinos em relação ao A. thaliana e B. botões florais napus é devido a mais de tecido compacto, com níveis mais elevados de compostos fenólicos e polissacarídeos. Durante a fixação e incorporação de algumas diferenças entre o A. thaliana / B. napus protocolo eo P. abies protocolo são evidentes. O tecido de juro é fixa para fornecer retenção de RNA e este é um passo crítico, pois materiais mal fixa pode dar um sinal de baixa ou indetectável mesmo que o mRNA é altamente abundante. O tecido é desidratado, limpo e embebido em cera em mudanças graduais para evitar danos aos tecidos e, em alguns protocolos de NaCl 0,85% é adicionado ao etanol na desidratação para continuar a evitar o encolhimento e inchaço da 3 células. A etapa de desidratação durante a incorporação pode ser realizada no gelo para manter a atividade RNase no mínimo. No P. abies protocolo de corrigir a solução de 4% paraformaldeído contém glutaraldeído 0,25%, o que é suposto dar uma melhor retenção de RNA 17, apesar de que alguns argumentam que ele provavelmente não fazem diferença 3. Depois de cortar o material é fixado em lâminas e pré-tratados (isto é, desparafinados, reidratados, permeabilizadas, tratado para reduzir a ligação não específica da sonda e, finalmente, desidratadas) antes da hibridização. No protocolo aqui apresentado o procedimento de detecção de todo pode ser realizado em laboratórios comuns, o sinal se desenvolve normalmente dentro de 1-3 dias ea relação entre o sinal sobre o fundo pode ser continuamente monitorado. A DIG sondas marcadas costumam dar um sinal mais distinta em comparação com sondas marcadas radioativos, são mais estáveis ​​e podem ser reutilizados em experimentos consecutivos. Por outro lado, a sensibilidade é reduzida em comparação com sondas radioativas 17. A hibridização in situ detecta expressão usando uma sonda marcada específico para um determinado mRNA. A marcação é um método de etiquetagem robusta e sensível, mas requer a manipulação da radioatividade e leva várias semanas antes que os resultados podem ser detectados. Antígeno marcado com sondas, por outro lado, são mais estáveis, menos perigosos e exigem uma exposição para o meio de detecção por alguns dias apenas 17 anos. Assim, o antígeno-rotulagem métodos são atualmente dominante. O passo mais crítico independentemente do protocolo é o projeto da sonda. Cuidados devem ser tomados para garantir que a sonda tem uma alta especificidade e é rotulado com UTPs de alta qualidade. Às vezes, a temperatura de hibridação e / ou comprimento de reação tem que ser ajustado para sondas específicas. Nosso protocolo modificado com base na DIG sondas marcadas irá facilitar a localização de expressão de mRNA, simultaneamente, em espécies que variam de A. thaliana a P. abies, e deve, com pequenos ajustes ser usado em outras espécies vegetais. O protocolo tem, ao lado de cones masculinos, também foi testado em diferentes estágios de brotos vegetativos e em embriões de ambos os zigóticos e somáticos de P. abies com bons resultados (resultados não publicados;. Karlgren et al).

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Acetic anhydride</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>A6404-200ml</td>
<td>minimum 98%</td>
</tr>
<tr>
<td>Acrylamide, linear</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Ambion</td>
<td>9520</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Anti-DIG-antibodies</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roche Applied Science</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Blocking reagent</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roche Applied Science</td>
<td>11 175 041 910 or 11 096 176 001</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Bovine serum albumin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>A7030-50g</td>
<td>minimum 98%</td>
</tr>
<tr>
<td>Deionized formamide</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Denhardts solution</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>D2532-5ml</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>DEPC, diethylpyrocarbonate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dextran sulfate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>DIG RNA Labeling Kit (SP6/T7)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roche Applied Science</td>
<td>11175025910</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Glutaraldehyde (25%)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Histolab products AB</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Glycogen</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Ambion</td>
<td>9510G</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Histoclear II</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Histolab products AB</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>You may use Tissue-clear, Histoclear II, xylen or something similar when embedding your tissue.</td>
</tr>
<tr>
<td>Histowax</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Histolab products AB</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Histowax or Paraplast can be used for embedding.</td>
</tr>
<tr>
<td>Paraformaldehyde</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>P6148-500g</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Paraplast plus</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>P3683-1kg</td>
<td>Histowax or Paraplast can be used for embedding.</td>
</tr>
<tr>
<td>Phusion&#x2122; High-Fidility DNA Polymerase</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Finnzymes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Probe-on Plus slides</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fischer Scientific</td>
<td>22-230-900</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Proteinase K</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>P2308-5mg</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>RNase A</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>R5503-100mg</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Tissue-clear</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sakura Finetek Europ&#233; BV</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>You may use Tissue-clear, Histoclear II, xylen or something similar when embedding your tissue.</td>
</tr>
<tr>
<td>Triethanolamine</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>T1377-100ml</td>
<td>minimum 98%</td>
</tr>
<tr>
<td>Triton X-100</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>use your standard product in the lab</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Use one or both of Triton X-100 and Tween-20.</td>
</tr>
<tr>
<td>tRNA</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>83853-100mg</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Tween-20</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>use your standard product in the lab</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Use one or both of Triton X-100 and Tween-20.</td>
</tr>
<tr>
<td>Western Blue</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Promega Corp.</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

non-radioactive in situ hybridization protocol applicable for norway spruce and a range of plant species

A tecnologias de alta capacidade de análise de expressão disponíveis hoje dar aos cientistas um estouro de perfis de expressão, mas a sua resolução em termos de expressão tecido específico é limitado devido a problemas em dissecar tecidos individual. Dados de expressão deve ser confirmado e complementado com padrões de expressão usando, por exemplo hibridização in situ, uma técnica utilizada para localizar a expressão de RNAm de células específicas. O método de hibridização in situ é trabalhoso, demorado e muitas vezes exige otimização extensa dependendo da espécie e do tecido. Em experimentos in situ são relativamente mais difíceis de executar em espécies lenhosas, como a Noruega coníferas spruce (Picea abies). Aqui apresentamos uma DIG modificado no protocolo de hibridização in situ, que é rápido e aplicável em uma ampla gama de espécies de plantas, incluindo P. abies. Com apenas alguns ajustes, incluindo alteradas RNase tratamento e concentração proteinase K, poderíamos usar o protocolo para estudar a expressão tecido específico de genes homólogos nos órgãos reprodutivos masculinos de uma gimnosperma e duas espécies de angiospermas; P. abies, Arabidopsis thaliana e Brassica napus. O protocolo funcionou tão bem para as espécies e genes estudados. AtAP3 e BnAP3 foram observados no segundo e terceiro whorl órgãos florais em A. thaliana e B. napus e DAL13 em microsporophylls de cones masculinos de P. abies. Para P. abies a concentração de K proteinase, usado para permeablize os tecidos, teve que ser aumentada para 3 g / ml em vez de 1 g / ml, possivelmente devido aos tecidos mais compactos e níveis mais elevados de compostos fenólicos e polissacarídeos. Para todas as espécies o tratamento RNase foi removido devido a intensidade do sinal reduzida sem um aumento correspondente na especificidade. Ao comparar os padrões de expressão tecido específico de genes homólogos de ambas as plantas floridas e uma árvore conífera demonstramos que a DIG situ no protocolo aqui apresentado, com apenas pequenos ajustes, pode ser aplicado a uma grande variedade de espécies de plantas. Assim, o protocolo evita tanto a otimização espécies extensa específicas ea utilização de sondas trabalhoso marcado radioativamente, em favor de sondas DIG rotulados. Nós escolhemos para ilustrar os passos tecnicamente exigente do protocolo em nosso filme. Anna Karlgren e Jenny Carlsson contribuíram igualmente para este estudo. Autores correspondentes: Anna Karlgren em Anna.Karlgren @ ebc.uu.se e Sundström Jens F. em Jens.Sundstrom @ vbsg.slu.se

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Non-radioactive in situ Hybridization Protocol Applicable for Norway Spruce and a Range of Plant Species

Nós descrevemos um DIG modificado<em&gt; In situ</em&gt; Protocolo de hibridização, que é rápido e aplicável em uma ampla gama de espécies de plantas, incluindo a Noruega abeto. Com apenas alguns ajustes, incluindo alteradas RNase tratamento e concentração proteinase K, o protocolo pode ser utilizado em estudos de diferentes tecidos e espécies.

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