Name: non-radioactive in situ hybridization protocol applicable for norway spruce and a range of plant species
Uploaded: 2009-04-17T00:00:00
Duration: 11 min 56 s
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Estamos muy agradecidos a Anders Bovin que proporcionó la música para la película y Michael Elliot acciones de voluntariado para ser la voz del altavoz. Se prestó apoyo por Carl Trygger Fundación, los objetivos estratégicos del programa de investigación agrícola de Genómica Funcional (AgriFunGen) de la Universidad Sueca de Ciencias Agrícolas, el Consejo Sueco de Investigación (VR), y el Consejo Sueco de Investigación para el Medio Ambiente, Ciencias Agrícolas, y Ordenación del Territorio (Formas ).

<ol>
	<li>Carr, S. M., Irish, V. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Floral+homeotic+gene+expression+defines+developmental+arrest+stages+in+Brassica+oleracea+L.+vars.+botrytis+and+italica.">Floral homeotic gene expression defines developmental arrest stages in Brassica oleracea L. vars. botrytis and italica.</a> Planta. 201 (2), 179-188 (1997).</li><li>Coen, E. S., Meyerowitz, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+war+of+the+whorls:+genetic+interactions+controlling+flower+development.">The war of the whorls: genetic interactions controlling flower development.</a> Nature. 353 (6339), 31-37 (1991).</li><li>Jackson, D., Gurr, S. J., McPherson, M. J., Bowles, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+hybridization+in+plants.">In situ hybridization in plants.</a> Molecular Plant Patology: a practical approach. , (1991).</li><li>Leitch, A. R., Schwarzacher, T., Jackson, D., Leitch, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> In situ hybridization: a practical guide. , (1994).</li><li>Smyth, D. R., Bowman, J. L., Meyerowitz, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+flower+development+in+Arabidopsis.">Early flower development in Arabidopsis.</a> Plant Cell. 2 (8), 755-767 (1990).</li><li>Azevedo, H., Lino-Neto, T., Tavares, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+method+for+high-quality+RNA+isolation+from+needles+of+adult+maritime+pine+trees.">An improved method for high-quality RNA isolation from needles of adult maritime pine trees.</a> Plant Molecular Biology Reporter. , 333-338 (2003).</li><li>Sundstrom, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MADS-box+genes+active+in+developing+pollen+cones+of+Norway+spruce+(Picea+abies)+are+homologous+to+the+B-class+floral+homeotic+genes+in+angiosperms.">MADS-box genes active in developing pollen cones of Norway spruce (Picea abies) are homologous to the B-class floral homeotic genes in angiosperms.</a> Dev Genet. 25 (3), 253-266 (1999).</li><li>Tandre, K., Svenson, M., Svensson, M. 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U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MADS-box+genes+reveal+that+gnetophytes+are+more+closely+related+to+conifers+than+to+flowering+plants.">MADS-box genes reveal that gnetophytes are more closely related to conifers than to flowering plants.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (13), 7342-7347 (1999).</li><li>Savard, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chloroplast+and+nuclear+gene+sequences+indicate+late+Pennsylvanian+time+for+the+last+common+ancestor+of+extant+seed+plants.">Chloroplast and nuclear gene sequences indicate late Pennsylvanian time for the last common ancestor of extant seed plants.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 91 (11), 5163-5167 (1994).</li><li>Jack, T., Brockman, L. L., Meyerowitz, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+homeotic+gene+APETALA3+of+Arabidopsis+thaliana+encodes+a+MADS+box+and+is+expressed+in+petals+and+stamens.">The homeotic gene APETALA3 of Arabidopsis thaliana encodes a MADS box and is expressed in petals and stamens.</a> Cell. 68 (4), 683-697 (1992).</li><li>Bowman, J. L., Smyth, D. R., Meyerowitz, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genes+directing+flower+development+in+Arabidopsis.">Genes directing flower development in Arabidopsis.</a> Plant Cell. 1 (1), 37-52 (1989).</li><li>Kramer, E. M., Irish, V. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+genetic+mechanisms+controlling+petal+development.">Evolution of genetic mechanisms controlling petal development.</a> Nature. 399 (6732), 144-148 (1999).</li><li>Sundstrom, J., Engstrom, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conifer+reproductive+development+involves+B-type+MADS-box+genes+with+distinct+and+different+activities+in+male+organ+primordia.">Conifer reproductive development involves B-type MADS-box genes with distinct and different activities in male organ primordia.</a> Plant J. 31 (2), 161-169 (2002).</li><li>Carlsson, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microarray+analysis+reveals+altered+expression+of+a+large+number+of+nuclear+genes+in+developing+cytoplasmic+male+sterile+Brassica+napus+flowers.">Microarray analysis reveals altered expression of a large number of nuclear genes in developing cytoplasmic male sterile Brassica napus flowers.</a> Plant J. 49 (3), 452-462 (2007).</li><li>Teixeira, R. T., Farbos, I., Glimelius, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+levels+of+meristem+identity+and+homeotic+genes+are+modified+by+nuclear-mitochondrial+interactions+in+alloplasmic+male-sterile+lines+of+Brassica+napus.">Expression levels of meristem identity and homeotic genes are modified by nuclear-mitochondrial interactions in alloplasmic male-sterile lines of Brassica napus.</a> Plant J. 42 (5), 731-742 (2005).</li><li>Ying, S., Kay, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+technique+of+in+situ+hybridization.">The technique of in situ hybridization.</a> Methods in Molecular Medicine. 56, 263-283 (2001).</li></ol>

Dos aspectos de la P. abies protocolo han sido optimizados en comparación con el A. thaliana / B. napus protocolo, RNasa tratamiento y la concentración de proteinasa K. La RNasa elimina las señales de fondo y por lo tanto aumenta la especificidad de la señal 17. El tratamiento con proteinasa K es necesaria para permeabilizar los tejidos por lo que la sonda se puede entrar y se hibridan con la piscina de ARN de interés. La sonda antisentido DAL13 dio una señal de alto, sin RNasa tratamiento (Fig. 3C, E, G) en comparación con las secciones tratadas con RNasa durante 30 minutos (Figura 2 D, F y H). Dado que la RNasa tratamiento no mejoró la señal que fue retirada del protocolo. El tratamiento con proteinasa K se pusieron a prueba a tres concentraciones diferentes: 1, 3 y 5 mg / ml. En el caso de P. abies una señal de baja o no se observó con 1 mg / ml de proteinasa K (Fig. 3C-D). Una señal fuerte se obtuvo con los 3 mg / ml (Fig. 3E-F) y 5 mg / ml (Fig. 3G-H) proteinasa K. Puesto que no hay diferencia aparente en la intensidad de la señal cuando se encontró con 5 mg / ml de proteinasa K en comparación con 3 mg / ml, se optó por utilizar 3 mg / ml en el protocolo. Es probable que la necesidad de una concentración de proteinasa K más alto en el P. abies conos masculinos en comparación con el A. thaliana y B. yemas florales napus se debe a la mayor cantidad de tejido compacto con altos niveles de compuestos fenólicos y polisacáridos. Durante la fijación e inclusión algunas diferencias entre el A. thaliana / B. napus protocolo y la P. abies protocolo son evidentes. El tejido de interés es fijo para proporcionar la retención de ARN y este es un paso crítico ya que los materiales mal fijo podría dar una señal de baja o no detectable a pesar de que el ARNm es muy abundante. El tejido se deshidrata, se aclaró y embebidos en cera en los cambios graduales para evitar daños en los tejidos, y en algunos protocolos de NaCl 0,85% se añade a la de etanol en la deshidratación para evitar aún más la contracción y la hinchazón de las tres células. La etapa de deshidratación durante la incrustación se puede realizar en el hielo para mantener la actividad RNasa como mínimo. En el P. abies protocolo de la solución de paraformaldehído al 4% solución contiene 0,25% de glutaraldehído, que se supone que para dar una mejor retención de ARN de 17 a pesar de que algunos sostienen que es probable que no hacen ninguna diferencia 3. Después de seccionar el material se fija en las diapositivas y los tratados previamente (es decir, desparafinado, rehidratada, permeabilized, tratados para reducir la unión no específica de la sonda y se deshidrata por fin) antes de la hibridación. En el protocolo que aquí se presenta el procedimiento de detección de todo se puede realizar en los laboratorios ordinarios, la señal se desarrolla por lo general dentro de 1-3 días y la relación entre la señal más de fondo continua puede controlarse. El DIG marcado sondas suelen dar una señal más clara, en comparación con sondas marcadas radiactivos, son más estables y pueden ser reutilizados en experimentos consecutivos. Por otro lado, la sensibilidad se reduce en comparación con sondas radiactivas 17. Hibridación in situ detecta expresión utilizando una sonda marcada específica para un determinado ARNm. Radio-etiquetado es un método de etiquetado robusta y sensible, pero requiere de un manejo de la radiactividad y toma varias semanas antes de que los resultados pueden ser detectados. Antígeno marcado con sondas por el contrario, son más estables, menos peligrosos y requieren de la exposición al medio de la detección de un par de días sólo 17 años. Por lo tanto, el etiquetado de antígeno métodos son actualmente dominantes. El paso más importante independientemente del protocolo es el diseño de la sonda. Se debe tener cuidado para asegurarse de que la sonda tiene una alta especificidad y se etiqueta con UTPs de alta calidad. A veces la temperatura de hibridación y / o la longitud de la reacción tiene que ser ajustado para las sondas específicas. Nuestro protocolo modificado sobre la base de la etiqueta DIG-sondas facilitará la localización de la expresión del ARNm de manera simultánea en las especies que van desde A. thaliana a P. abies, y que con algunos ajustes menores pueda utilizarse en otras especies vegetales. El protocolo, además de los conos masculinos, también ha sido probado en diferentes etapas de brotes vegetativos y en ambos cigóticos y somáticos de P. abies, con buenos resultados (resultados no publicados;. Karlgren et al).

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Acetic anhydride</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>A6404-200ml</td>
<td>minimum 98%</td>
</tr>
<tr>
<td>Acrylamide, linear</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Ambion</td>
<td>9520</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Anti-DIG-antibodies</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roche Applied Science</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Blocking reagent</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roche Applied Science</td>
<td>11 175 041 910 or 11 096 176 001</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Bovine serum albumin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>A7030-50g</td>
<td>minimum 98%</td>
</tr>
<tr>
<td>Deionized formamide</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Denhardts solution</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>D2532-5ml</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>DEPC, diethylpyrocarbonate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dextran sulfate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>DIG RNA Labeling Kit (SP6/T7)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roche Applied Science</td>
<td>11175025910</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Glutaraldehyde (25%)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Histolab products AB</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Glycogen</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Ambion</td>
<td>9510G</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Histoclear II</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Histolab products AB</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>You may use Tissue-clear, Histoclear II, xylen or something similar when embedding your tissue.</td>
</tr>
<tr>
<td>Histowax</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Histolab products AB</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Histowax or Paraplast can be used for embedding.</td>
</tr>
<tr>
<td>Paraformaldehyde</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>P6148-500g</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Paraplast plus</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>P3683-1kg</td>
<td>Histowax or Paraplast can be used for embedding.</td>
</tr>
<tr>
<td>Phusion&#x2122; High-Fidility DNA Polymerase</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Finnzymes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Probe-on Plus slides</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fischer Scientific</td>
<td>22-230-900</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Proteinase K</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>P2308-5mg</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>RNase A</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>R5503-100mg</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Tissue-clear</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sakura Finetek Europ&#233; BV</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>You may use Tissue-clear, Histoclear II, xylen or something similar when embedding your tissue.</td>
</tr>
<tr>
<td>Triethanolamine</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>T1377-100ml</td>
<td>minimum 98%</td>
</tr>
<tr>
<td>Triton X-100</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>use your standard product in the lab</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Use one or both of Triton X-100 and Tween-20.</td>
</tr>
<tr>
<td>tRNA</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>83853-100mg</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Tween-20</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>use your standard product in the lab</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Use one or both of Triton X-100 and Tween-20.</td>
</tr>
<tr>
<td>Western Blue</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Promega Corp.</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

non-radioactive in situ hybridization protocol applicable for norway spruce and a range of plant species

Las tecnologías de la expresión de alto rendimiento de análisis disponibles en la actualidad a los científicos un desbordamiento de perfiles de expresión, pero su solución en términos de expresión específica de tejido es limitado debido a problemas en la disección de los distintos tejidos. Los datos de expresión tiene que ser confirmada y completada con los patrones de expresión utilizando por ejemplo la hibridación in situ, una técnica utilizada para localizar la expresión de ARNm de células específicas. El método de hibridación in situ es laboriosa, consume tiempo y requiere a menudo una amplia optimización dependiendo de la especie y el tejido. En experimentos in situ son relativamente más difíciles de realizar en las especies leñosas, como el abeto de coníferas de Noruega (Picea abies). Aquí les presentamos una modificación en el protocolo DIG hibridación in situ, que es rápido y es aplicable en una amplia gama de especies de plantas incluyendo P. abies. Con sólo unos pocos ajustes, incluyendo el tratamiento altera la concentración de RNasa y proteinasa K, se podría utilizar el protocolo de estudio de la expresión específica de tejido de genes homólogos en los órganos reproductivos masculinos de una gimnospermas y dos especies de angiospermas, P. abies, Arabidopsis thaliana y Brassica napus. El protocolo funcionó igual de bien para las especies y los genes estudiados. AtAP3 y BnAP3 se observaron en el segundo y tercer verticilo órganos florales en A. thaliana y B. napus y DAL13 en microsporophylls de conos masculinos de P. abies. Por P. abies la concentración de proteinasa K, que se utiliza para permeablize los tejidos, tuvo que ser aumentada a 3 g / ml en lugar de 1 g / ml, posiblemente debido a los tejidos más compactos y más altos niveles de compuestos fenólicos y polisacáridos. Para todas las especies el tratamiento RNasa fue retirado debido a la reducida fuerza de la señal sin el correspondiente aumento de la especificidad. Al comparar los patrones de tejidos específicos de la expresión de genes homólogos de las plantas con flores como de un árbol de coníferas nos demuestran que la DIG en el protocolo situ que aquí se presenta, con sólo pequeños ajustes, se puede aplicar a una amplia gama de especies de plantas. Por lo tanto, el protocolo evita tanto la optimización de las especies extensa específicos y el uso de sondas laborioso marcado radiactivamente a favor de las sondas DIG etiquetados. Hemos elegido para ilustrar los pasos técnicamente exigentes del protocolo en nuestra película. Anna Karlgren y Carlsson Jenny contribuyeron igualmente a este estudio. Con los autores: Anna Karlgren en Anna.Karlgren @ ebc.uu.se y Sundström Jens F. en Jens.Sundstrom @ vbsg.slu.se

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Non-radioactive in situ Hybridization Protocol Applicable for Norway Spruce and a Range of Plant Species

Se describe una modificación DIG<em&gt; In situ</em&gt; Protocolo de hibridación, que es rápido y es aplicable en una amplia gama de especies de plantas como el abeto rojo. Con sólo unos pocos ajustes, incluyendo el tratamiento altera la concentración de RNasa y proteinasa K, el protocolo puede ser utilizado en los estudios de los diferentes tejidos y especies.

No radiactivo In situ La hibridación aplicable para el abeto rojo protocolo y una serie de especies de plantas

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