Name: identification of protein complexes with quantitative proteomics in s. cerevisiae
Uploaded: 2009-03-04T00:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Identification of protein complexes with quantitative proteomics in S. cerevisiae at JoVE.com

مواد وطرق <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> سلالات الخميرة <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وتستند جميع السلالات المستخدمة في هذه الدراسة على خلفية BY4742. أدلى التزاوج arg4 سلالة الحذف (بساط أ ، his3 ، ura3 ، leu2 وarg4 : G418) : سلالة تحكم SILAC...

<ol>
	<li>Loewen, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inheritance+of+cortical+ER+in+yeast+is+required+for+normal+septin+organization.">Inheritance of cortical ER in yeast is required for normal septin organization.</a> Jour. Cell Biol. 179, 467-483 .</li><li>Ong, S., Foster, L. J., Hoog, C. L., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+spectrometric-based+approaches+in+quantitative+proteomics.">Mass spectrometric-based approaches in quantitative proteomics.</a> Methods. 29, 124-130 .</li><li>Puig, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Tandem+Affinity+Purification+(TAP)+method:+a+general+procedure+of+protein+complex+purification.">The Tandem Affinity Purification (TAP) method: a general procedure of protein complex purification.</a> Methods. 24, 218-229 .</li><li>Amberg, D. C., Burke, D. J., Strathern, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+in+Yeast+Genetics.">Methods in Yeast Genetics.</a> , 123-125 .</li></ol>

ينبغي أن aliquots حفظ أثناء إجراء تنقية ما يلي : (1) lysate الخلية قبل تطهيرها ، (2) جزء محدد ، (3) جزء غير منضم ، و (4) جزء eluted. نوصي تحليل محتويات البروتين من aliquots أعلاه الغربية النشاف استخدام الألغام المضادة TAP الضد أو تلطيخ الفضة لتعكس كفاءة ملزمة ويبلغ حجمه من التجربة. وترد أمثل?...

identification of protein complexes with quantitative proteomics in s. cerevisiae

الدهون هي لبنات بناء الأغشية الخلوية التي تعمل كحواجز وتجزئة العمليات الخلوية ، ومؤخرا ، كما يشير الى جزيئات هامة بين الخلايا. لكن ، على عكس البروتينات ، والدهون هي عبارة عن جزيئات صغيرة مسعور أن الاتجار في المقام الأول عبر طرق سيئة nonvesicular صفها ، والتي يفترض أن تحدث في مواقع الاتصال غشاء (MCSS). MCSS هي المناطق التي تكون فيها شبكية هيولي باطني (ER) يجعل الاتصال الجسدي المباشر مع العضية الشراكة ، مثل غشاء البلازما (بعد الظهر). تم تخصيب جزء من ER ER - PM - MCSS في أنزيمات الدهون التوليف ، مما يشير إلى أن يتم توجيه توليف الدهون لهذه المواقع ، ومما يدل على أن MCSS مهمة لحركة الدهون. الخميرة هو نموذج مثالي لدراسة ER - PM MCSS بسبب وفرة فيها ، مع أكثر من 1000 اتصال في كل خلية ، وطبيعتها الحفظ في جميع حقيقيات النوى. الكشف عن البروتينات التي تشكل MCSS أمر بالغ الأهمية لفهم كيف يتم إنجاز حركة الدهون في الخلايا ، وكيف يتصرفون كما يشير الجزيئات. لقد وجدنا أن ER دعا إلى توطين Scs2p ER - PM MCSS والمهم لتشكيلها. نحن نركز على الكشف عن شركاء الجزيئي للScs2p. تحديد بروتين المجمعات تعتمد تقليديا على حل اول عينات البروتين يطهر هلام إستشراد ، تليها في هلام هضم البروتين العصابات وتحليل الببتيدات بواسطة مطياف الكتلة. وهذا يحد كثيرا من دراسة لمجموعة فرعية صغيرة من البروتينات. أيضا ، ويتعرض لتغيير طبيعة البروتين المجمعات أو ظروف غير الفسيولوجية أثناء العملية. للتحايل على هذه المشاكل ، ونفذنا واسعة النطاق الكمي البروتيوميات تقنية لاستخراج البيانات غير منحازة وكميا. نستخدم الوسم النظائر مستقرة مع الأحماض الأمينية في الثقافة الخلية (SILAC) لدمج أنوية النظائر الأساسية في البروتينات في سلالة تحكم معلم. يتم خلط كميات متساوية من ثقافة المفتاحية ومعلم ، والثقافة SILAC المسمى معا وlysed قبل الطحن في النيتروجين السائل. نحن ثم تنفيذ إجراء تنقية تقارب لهدم المجمعات البروتين. وأخيرا ، فإننا يعجل عينة البروتين ، والذي هو على استعداد لتحليلها من قبل اللوني السائل عالي الأداء / مطياف الكتلة جنبا إلى جنب. الأهم من ذلك ، وصفت البروتينات في سلالة سيطرة النظائر الثقيلة وسوف ينتج التحول الشامل / التهمة التي يمكن قياسها كميا ضد بروتينات غير المسماة في سلالة الطعم. لذا ، يمكن الملوثات ، أو غير محددة ملزمة القضاء عليها بسهولة. باستخدام هذا النهج ، حددنا البروتينات الرواية عدة لتوطين ER - PM MCSS. هنا نقدم وصفا مفصلا لنهجنا.

Watch this Scientific Journal Video about Identification of protein complexes with quantitative proteomics in S. cerevisiae at JoVE.com

Identification of protein complexes with quantitative proteomics in S. cerevisiae

نحن هنا وصف تقنية جديدة لتحديد كمية البروتينات البروتين في المجمعات الجعوية السكيراء. في هذه الدراسة ، وقد استخدمنا أسلوب SILAC مع تنقية تقارب تليها بالترادف الطيف الكتلي لتحديد نوعية عالية مع الشركاء ملزمة للبروتين ER ، Scs2p.

تحديد بروتين المجمعات مع كمية البروتينات في البيرة س.

Lipids are the building blocks of cellular membranes that function as barriers and in compartmentalization of cellular processes, and recently, as ...

Research

JoVE Journal

Biology

Assay for Adhesion and Agar Invasion in S. cerevisiae

مقايسة للالتصاق وغزو آجار في البيرة س.

Yeasts are found in natural biofilms, where many microorganisms colonize surfaces. In artificial environments, such as surfaces of man-made objects, ...

Proteomics to Identify Proteins Interacting with P2X2 Ligand-Gated Cation Channels

البروتيوميات من التعرف على البروتينات التفاعل مع P2X2 قنوات الكاتيون يجند بوابات

Ligand-gated ion channels underlie synaptic communication in the nervous system1. In mammals there are three families of ligand-gated channels: the cys ...

A high-throughput method to globally study the organelle morphology in S. cerevisiae

أسلوب الإنتاجية العالية عالميا لدراسة مورفولوجية عضية في البيرة س.

High-throughput methods to examine protein localization or organelle morphology is an effective tool for studying protein interactions and can help ...

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

حفز Phosphoproteomics الكمية في الأحماض الدهنية السكيراء الجعوية</em

This protocol describes the growth and stimulation, with the fatty acid oleate, of isotopically heavy and light S. cerevisiae cells. Cells are ground ...

Studying Age-dependent Genomic Instability using the S. cerevisiae Chronological Lifespan Model

Studying Age-dependent Genomic Instability using the S. cerevisiae Chronological Lifespan Model

دراسة السن التي تعتمد على عدم الاستقرار الجيني باستخدام س. خميرة يفسبن الزمني النموذجي

Studies using the Saccharomyces cerevisiae aging model have uncovered life span regulatory pathways that are partially conserved in higher eukaryotes1-2. ...

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

تحديد بروتين في مجمعات<em&gt; كولاي</em&gt; استخدام المتعاقبة تنقية تقارب الببتيد في تركيبة مع جنبا إلى جنب الطيف الكتلي

Since most cellular processes are mediated by macromolecular assemblies, the systematic identification of protein-protein interactions (PPI) and the ...

Flow Cytometry-based Purification of S. cerevisiae Zygotes

Flow Cytometry-based Purification of S. cerevisiae Zygotes

تدفق الخلوي على أساس تنقية<em&gt; S. خميرة</em&gt; بيضات ملقحة

Zygotes are essential intermediates between haploid and diploid states in the life cycle of many organisms, including yeast (Figure 1) 1. S. cerevisiae ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

التصور والتحليل من جزيئات الرنا المرسال عن طريق الإسفار<em&gt; في الموضع</em&gt; التهجين في<em&gt; خميرة الخباز</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

فحوصات بالإضافة لرصد طوي ثانية بروتين في<em&gt; خميرة الخباز</em

Proteostasis, defined as the combined processes of protein folding/biogenesis, refolding/repair, and degradation, is a delicate cellular balance that must ...

Identification of Post-translational Modifications of Plant Protein Complexes

تحديد التعديلات بعد متعدية من النباتات بروتين المجمعات

Plants adapt quickly to changing environments due to elaborate perception and signaling systems. During pathogen attack, plants rapidly respond to ...