Name: identification of protein complexes with quantitative proteomics in s. cerevisiae
Uploaded: 2009-03-04T00:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Identification of protein complexes with quantitative proteomics in S. cerevisiae at JoVE.com

Materialen en methoden <ol><li> Giststammen <ul><li> Alle stammen die in deze studie zijn gebaseerd op de BY4742 achtergrond. De SILAC controle stam (Mat een, his3, leu2, ura3, lys2 en Arg4:: G418) werd gemaakt door voortplanting Arg4 verwijdering stam (Mat een, his3, ura3, leu2 en Arg4:: G418) naar BY4742 (Mat alpha, his3, leu2, ura3 en lys2), en de meiotische haploiden werden verkregen door tetrade dissectie. Dat de controle op stam is een auxotroph voor lysine en arginine. Het aa...

<ol>
	<li>Loewen, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inheritance+of+cortical+ER+in+yeast+is+required+for+normal+septin+organization.">Inheritance of cortical ER in yeast is required for normal septin organization.</a> Jour. Cell Biol. 179, 467-483 .</li><li>Ong, S., Foster, L. J., Hoog, C. L., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+spectrometric-based+approaches+in+quantitative+proteomics.">Mass spectrometric-based approaches in quantitative proteomics.</a> Methods. 29, 124-130 .</li><li>Puig, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Tandem+Affinity+Purification+(TAP)+method:+a+general+procedure+of+protein+complex+purification.">The Tandem Affinity Purification (TAP) method: a general procedure of protein complex purification.</a> Methods. 24, 218-229 .</li><li>Amberg, D. C., Burke, D. J., Strathern, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+in+Yeast+Genetics.">Methods in Yeast Genetics.</a> , 123-125 .</li></ol>

De fracties opgeslagen tijdens de zuivering procedure moet omvatten (1) pre-gewist cellysaat, (2) gebonden fractie, (3) niet-gebonden fractie, en (4) geëlueerd fractie. Wij raden aan het analyseren van het eiwit inhoud van de bovenstaande aliquots door Western blotting gebruik van anti-TAP antilichaam of zilverkleuring om de binding en het elueren van de efficiëntie van het experiment weer te geven. Voorbeelden van een zilveren gekleurde gel en een blot worden weergegeven in Figuur 1. Sind...

identification of protein complexes with quantitative proteomics in s. cerevisiae

Vetten zijn de bouwstenen van de cellulaire membranen die als barrières en in compartimentering van cellulaire processen, en sinds kort, net zo belangrijk intracellulaire signaalmoleculen. Echter, in tegenstelling tot eiwitten, lipiden zijn kleine hydrofobe moleculen die het verkeer in de eerste plaats door slecht beschreven nonvesicular routes, die worden verondersteld voor te komen bij membraan contact sites (MCSS). MCSS zijn regio&#39;s waar het endoplasmatisch reticulum (ER) direct fysiek contact maakt met een partnering organel, bijvoorbeeld, plasmamembraan (PM). De ER deel van de ER-PM MCSS is verrijkt met lipide-synthese enzymen, wat suggereert dat lipide-synthese is gericht op deze sites en implicerend dat MCSS van belang zijn voor lipide verkeer. Gist is een ideaal model om ER-PM MCSS studie omwille van hun overvloed, met meer dan 1000 contacten per cel, en hun geconserveerd natuur in al eukaryoten. Het blootleggen van de eiwitten die MCSS vormen is van cruciaal belang om te begrijpen hoe lipiden verkeer gebeurt in de cellen, en hoe ze handelen als signaalmoleculen. We hebben vastgesteld dat een ER geroepen Scs2p lokaliseren aan ER-PM MCSS en is belangrijk voor hun vorming. We zijn gericht op het blootleggen van de moleculaire partners van Scs2p. Identificatie van eiwit complexen steunt traditioneel op de eerste het oplossen van gezuiverde eiwit monsters door gel elektroforese, gevolgd door in-gel vertering van eiwitten bands en de analyse van peptiden met behulp van massaspectrometrie. Dit beperkt vaak de studie om een ​​kleine subset van eiwitten. Ook zijn eiwitcomplexen blootgesteld aan denaturering of niet-fysiologische omstandigheden tijdens de procedure. Om deze problemen te omzeilen, hebben we een grootschalig kwantitatief proteomics techniek om onpartijdige en gekwantificeerde gegevens te extraheren. We maken gebruik van stabiele isotopen de etikettering met aminozuren in cel cultuur (SILAC) te nieten isotoop kernen op te nemen in eiwitten in een niet-gelabelde controle stam. Gelijke volumes gelabeld cultuur en niet-gecodeerde, SILAC-label cultuur worden vermengd en gelyseerd door malen in vloeibare stikstof. We voeren vervolgens een affiniteitszuivering procedure om pull-down eiwitcomplexen. Ten slotte hebben we het eiwit neerslag monster, die klaar is voor analyse door high-performance vloeistofchromatografie / tandem massaspectrometrie. Nog belangrijker, worden eiwitten in de controle stam gelabeld door de zware isotoop en zal een massa / lading shift die kan tegen de niet-gelabelde eiwitten worden gekwantificeerd in het aas stam te produceren. Daarom kunnen verontreinigingen of niet-specifieke binding gemakkelijk kunnen worden verwijderd. Door deze aanpak, hebben we een aantal nieuwe eiwitten die lokaliseren aan ER-PM MCSS. Hier presenteren we een gedetailleerde beschrijving van onze aanpak.

Watch this Scientific Journal Video about Identification of protein complexes with quantitative proteomics in S. cerevisiae at JoVE.com

Identification of protein complexes with quantitative proteomics in S. cerevisiae

Hier beschrijven we een nieuwe kwantitatieve proteomics-techniek voor het identificeren van eiwitcomplexen in Saccharomyces cerevisiae. In deze studie hebben we gebruik gemaakt van de SILAC methode, samen met affiniteit zuivering, gevolgd door tandem massaspectrometrie te identificeren met een hoge specificiteit van de binding partners van een ER-eiwit, Scs2p.

Identificatie van eiwit-complexen met kwantitatieve proteomics in S. cerevisiae

Lipids are the building blocks of cellular membranes that function as barriers and in compartmentalization of cellular processes, and recently, as ...

Research

JoVE Journal

Biology

Assay for Adhesion and Agar Invasion in S. cerevisiae

Test voor Adhesie en Agar invasie in S. cerevisiae

Yeasts are found in natural biofilms, where many microorganisms colonize surfaces. In artificial environments, such as surfaces of man-made objects, ...

Proteomics to Identify Proteins Interacting with P2X2 Ligand-Gated Cation Channels

Proteomics om eiwitten Interactie met P2X2 ligand-gated kationenkanalen identificeren

Ligand-gated ion channels underlie synaptic communication in the nervous system1. In mammals there are three families of ligand-gated channels: the cys ...

A high-throughput method to globally study the organelle morphology in S. cerevisiae

Een high-throughput methode om wereldwijd de studie van de morfologie organel in S. cerevisiae

High-throughput methods to examine protein localization or organelle morphology is an effective tool for studying protein interactions and can help ...

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

Kwantitatieve Phosphoproteomics in Fatty Acid Gestimuleerd Saccharomyces cerevisiae</em

This protocol describes the growth and stimulation, with the fatty acid oleate, of isotopically heavy and light S. cerevisiae cells. Cells are ground ...

Studying Age-dependent Genomic Instability using the S. cerevisiae Chronological Lifespan Model

Studying Age-dependent Genomic Instability using the S. cerevisiae Chronological Lifespan Model

Studeren Age-afhankelijke genomische instabiliteit met behulp van de S. cerevisiae Chronologische levensduur Model

Studies using the Saccharomyces cerevisiae aging model have uncovered life span regulatory pathways that are partially conserved in higher eukaryotes1-2. ...

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Identificatie van eiwit complexen in<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Met Sequential Peptide Affinity Purification in combinatie met tandem massaspectrometrie

Since most cellular processes are mediated by macromolecular assemblies, the systematic identification of protein-protein interactions (PPI) and the ...

Flow Cytometry-based Purification of S. cerevisiae Zygotes

Flow Cytometry-based Purification of S. cerevisiae Zygotes

Flowcytometrie gebaseerde Zuivering van<em&gt; S. cerevisiae</em&gt; Zygoten

Zygotes are essential intermediates between haploid and diploid states in the life cycle of many organisms, including yeast (Figure 1) 1. S. cerevisiae ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

Visualisatie en analyse van mRNA moleculen met behulp van fluorescentie<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisatie in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

Gekoppeld Testen voor Monitoring Protein Refolding in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Proteostasis, defined as the combined processes of protein folding/biogenesis, refolding/repair, and degradation, is a delicate cellular balance that must ...

Identification of Post-translational Modifications of Plant Protein Complexes

Identificatie van post-translationele modificaties van Plant eiwitcomplexen

Plants adapt quickly to changing environments due to elaborate perception and signaling systems. During pathogen attack, plants rapidly respond to ...