Name: identification of protein complexes with quantitative proteomics in s. cerevisiae
Uploaded: 2009-03-04T00:00:00
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Material und Methoden <ol><li> Hefestämme <ul><li> Alle Stämme in dieser Studie basieren auf der BY4742 Hintergrund. Der SILAC Kontrollstamm (Mat a, his3, leu2, ura3, lys2 und arg4: G418): bis BY4742 (Mat alpha wurde durch Paarung arg4 Löschung Stamm (: G418 Mat a, HIS3, URA3, LEU2 und arg4) gemacht his3, leu2, ura3 und lys2) und der meiotischen Haploiden wurden von Tetrade Dissektion erhalten. Daher ist die Kontrolle Stamm eine auxotroph für Lysin und Arginin. Der Köd...

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	<li>Loewen, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inheritance+of+cortical+ER+in+yeast+is+required+for+normal+septin+organization.">Inheritance of cortical ER in yeast is required for normal septin organization.</a> Jour. Cell Biol. 179, 467-483 .</li><li>Ong, S., Foster, L. J., Hoog, C. L., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+spectrometric-based+approaches+in+quantitative+proteomics.">Mass spectrometric-based approaches in quantitative proteomics.</a> Methods. 29, 124-130 .</li><li>Puig, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Tandem+Affinity+Purification+(TAP)+method:+a+general+procedure+of+protein+complex+purification.">The Tandem Affinity Purification (TAP) method: a general procedure of protein complex purification.</a> Methods. 24, 218-229 .</li><li>Amberg, D. C., Burke, D. J., Strathern, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+in+Yeast+Genetics.">Methods in Yeast Genetics.</a> , 123-125 .</li></ol>

Die Aliquots während der Reinigungsprozedur gespeichert werden sollen umfassen (1) mit bereits geklärten Zelllysat, (2) gebundenen Fraktion (3), ungebundene Fraktion, und (4) eluierte Fraktion. Wir empfehlen die Analyse der Protein Inhalt der oben Aliquots durch Western-Blot mit anti-TAP-Antikörper oder Silberfärbung, die Bindung und Elution Effizienz des Experiments zu reflektieren. Beispiele für eine mit Silber gefärbten Gel und ein Schandfleck sind in Abbildung 1 dargestellt. Da SIL...

identification of protein complexes with quantitative proteomics in s. cerevisiae

Lipide sind die Bausteine ​​der Zellmembranen, die als Barrieren und in Abschottung von zellulären Prozessen, und vor kurzem, wie wichtig intrazellulären Signalmolekülen. Doch im Gegensatz zu Proteinen, Lipiden sind kleine hydrophobe Moleküle, dass der Verkehr vor allem durch schlecht beschrieben nonvesicular Routen, die die Hypothese aufgestellt, um an der Membran Kontaktstellen (MCS) auftreten. MCSs sind Regionen, in denen das endoplasmatische Retikulum (ER) ermöglicht den direkten körperlichen Kontakt mit einem Partner Organellen, zB Plasmamembran (PM). Die ER Teil des ER-PM MCSs ist in lipid-synthetisierenden Enzyme angereichert, was darauf hindeutet, dass Lipid-Synthese zu diesen Seiten gerichtet ist und was impliziert, dass MCSs wichtig sind für die Lipid-Verkehr. Hefe ist ein ideales Modell, um ER-PM MCSs wegen ihrer Fülle Studie mit über 1000 Kontakten pro Zelle, und ihre konservierte Natur in allen Eukaryoten. Das Aufdecken der Proteine, die MCSs bilden ist entscheidend für das Verständnis, wie Lipide Verkehr in Zellen erreicht wird, und wie sie wirken als Signalmoleküle. Wir haben festgestellt, dass ein ER genannt Scs2p zu ER-PM MCSs lokalisieren und ist für ihre Bildung wichtig. Wir sind auf die Aufdeckung der molekularen Partner Scs2p konzentriert. Identifizierung von Protein-Komplexen beruht traditionell auf der ersten Lösung gereinigtes Protein-Proben mittels Gelelektrophorese, durch In-Gel-Verdauung von Eiweiß Bands und Analyse von Peptiden durch Massenspektrometrie verfolgt. Diese oft Grenzen der Studie auf eine kleine Teilmenge von Proteinen. Außerdem werden Protein-Komplexe zu denaturieren oder nicht-physiologischen Bedingungen während des Verfahrens ausgesetzt. Um diese Probleme zu umgehen, haben wir eine groß angelegte quantitative Proteomics-Technik für eine objektive und quantifizierte Daten zu extrahieren umgesetzt. Wir verwenden stabile Isotopenmarkierung mit Aminosäuren in der Zellkultur (SILAC) zu heften Isotop Kerne in Proteine ​​einzubauen in einem untagged Kontrollstamm. Gleiche Volumina getaggt Kultur und untagged, SILAC-markierten Kultur miteinander vermischt und lysiert durch Schleifen in flüssigem Stickstoff. Wir führen dann eine Affinität Reinigungsverfahren nach unten ziehen, Protein-Komplexen. Schließlich Niederschlag wir die Proteinprobe, die bereit sind für die Analyse durch Hochleistungs-Flüssigkeits-Chromatographie / Tandem-Massenspektrometrie ist. Am wichtigsten ist, sind Proteine ​​in der Kontrolle Belastung durch das schwere Isotop markiert und wird eine Masse / Ladungs-Verschiebung, die gegen die unmarkierte Proteine ​​in den Köder Belastung quantifiziert werden können, zu produzieren. Daher können Verunreinigungen oder unspezifische Bindung leicht beseitigt werden. Durch diesen Ansatz haben wir mehrere neue Proteine, die ER-MCSs PM lokalisieren identifiziert. Hier präsentieren wir Ihnen eine detaillierte Beschreibung unseres Ansatzes.

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Identification of protein complexes with quantitative proteomics in S. cerevisiae

Hier beschreiben wir eine neue quantitative Proteomik Verfahren zur Identifizierung von Protein-Komplexen in Saccharomyces cerevisiae. In dieser Studie haben wir die SILAC-Methode zusammen mit Affinitätsreinigung durch Tandem-Massenspektrometrie gefolgt, um mit hoher Spezifität zu identifizieren die Bindungspartner einer ER-Protein, Scs2p verwendet.

Identifizierung von Protein-Komplexen mit der quantitativen Proteomik in S. cerevisiae

Lipids are the building blocks of cellular membranes that function as barriers and in compartmentalization of cellular processes, and recently, as ...

Research

JoVE Journal

Biology

Assay for Adhesion and Agar Invasion in S. cerevisiae

Assay für Adhäsion und Agar Invasion in S. cerevisiae

Yeasts are found in natural biofilms, where many microorganisms colonize surfaces. In artificial environments, such as surfaces of man-made objects, ...

Forschung

Biologie

Proteomics to Identify Proteins Interacting with P2X2 Ligand-Gated Cation Channels

Proteomics, um Proteine ​​interagieren mit P2X2 Ligand-Gated Kationenkanäle Identifizieren

Ligand-gated ion channels underlie synaptic communication in the nervous system1. In mammals there are three families of ligand-gated channels: the cys ...

A high-throughput method to globally study the organelle morphology in S. cerevisiae

Ein High-Throughput-Verfahren zur global Studie der Organellen-Morphologie in S. cerevisiae

High-throughput methods to examine protein localization or organelle morphology is an effective tool for studying protein interactions and can help ...

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae</em

This protocol describes the growth and stimulation, with the fatty acid oleate, of isotopically heavy and light S. cerevisiae cells. Cells are ground ...

Studying Age-dependent Genomic Instability using the S. cerevisiae Chronological Lifespan Model

Studying Age-dependent Genomic Instability using the S. cerevisiae Chronological Lifespan Model

Studieren Altersabhängige genomische Instabilität mit der S. cerevisiae Chronologisch Lebensdauer Modell

Studies using the Saccharomyces cerevisiae aging model have uncovered life span regulatory pathways that are partially conserved in higher eukaryotes1-2. ...

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Identifizierung von Protein-Komplexen in<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Mit Sequential Peptide Affinity Purification in Kombination mit Tandem-Massenspektrometrie

Since most cellular processes are mediated by macromolecular assemblies, the systematic identification of protein-protein interactions (PPI) and the ...

Flow Cytometry-based Purification of S. cerevisiae Zygotes

Flow Cytometry-based Purification of S. cerevisiae Zygotes

Durchflusszytometrie-basierte Reinigung von<em&gt; S. cerevisiae</em&gt; Zygotes

Zygotes are essential intermediates between haploid and diploid states in the life cycle of many organisms, including yeast (Figure 1) 1. S. cerevisiae ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

Visualisierung und Analyse von mRNA Moleküle mittels Fluoreszenz<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisierung in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

Gekoppelt Assays zur Überwachung Proteinrückfaltung in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Proteostasis, defined as the combined processes of protein folding/biogenesis, refolding/repair, and degradation, is a delicate cellular balance that must ...

Identification of Post-translational Modifications of Plant Protein Complexes

Bezeichnung des Post-translationale Modifikationen von Pflanzenproteinkomplexe

Plants adapt quickly to changing environments due to elaborate perception and signaling systems. During pathogen attack, plants rapidly respond to ...