Name: identification of protein complexes with quantitative proteomics in s. cerevisiae
Uploaded: 2009-03-04T00:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Identification of protein complexes with quantitative proteomics in S. cerevisiae at JoVE.com

חומרים ושיטות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זני שמרים <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כל הזנים המשמשים במחקר זה מבוססים על רקע BY4742. זן השליטה SILAC (מחצלת, his3, leu2, ura3, lys2 ו arg4: G418) נעשתה על ידי הזדווגות arg4 זן המחיקה (מחצלת, his3, ...

<ol>
	<li>Loewen, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inheritance+of+cortical+ER+in+yeast+is+required+for+normal+septin+organization.">Inheritance of cortical ER in yeast is required for normal septin organization.</a> Jour. Cell Biol. 179, 467-483 .</li><li>Ong, S., Foster, L. J., Hoog, C. L., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+spectrometric-based+approaches+in+quantitative+proteomics.">Mass spectrometric-based approaches in quantitative proteomics.</a> Methods. 29, 124-130 .</li><li>Puig, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Tandem+Affinity+Purification+(TAP)+method:+a+general+procedure+of+protein+complex+purification.">The Tandem Affinity Purification (TAP) method: a general procedure of protein complex purification.</a> Methods. 24, 218-229 .</li><li>Amberg, D. C., Burke, D. J., Strathern, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+in+Yeast+Genetics.">Methods in Yeast Genetics.</a> , 123-125 .</li></ol>

Aliquots הציל במהלך ההליך טיהור צריכה לכלול (1) מראש פינה lysate התא, (2) חלק מחויב, (3) חלק מאוגד, ו (4) חלק eluted. אנו ממליצים על ניתוח תוכן של חלבון aliquots לעיל על ידי המערב סופג באמצעות נוגדן אנטי מכתים TAP או כסף כדי לשקף את היעילות מחייב משחררי הניסוי. דוגמאות של ג&#39;ל מוכתם כסף כתם מ?...

identification of protein complexes with quantitative proteomics in s. cerevisiae

ליפידים הם אבני הבניין של ממברנות הסלולר המתפקדים מחסומים ועל מידור של תהליכים תאיים, ולאחרונה, כפי חשוב מולקולות איתות תאיים. עם זאת, בניגוד חלבונים, שומנים הם מולקולות הידרופוביות קטנות תעבורה בעיקר על ידי נתיבי nonvesicular תיאר גרוע, שהם שיערו להתרחש בכל מגע אתרים קרום (MCSs). MCSs הם אזורים שבהם reticulum endoplasmic (ER) עושה מגע פיזי ישיר עם אברון משתפת פעולה, למשל, פלזמה הממברנה (PM). החלק המיון של ER-PM MCSs הוא מועשר ב שומנים לסנתז אנזימים, טוען כי סינתזה השומנים מופנית לאותם אתרים רומז כי MCSs חשובים תנועה השומנים. שמרים הוא מודל אידיאלי ללמוד ER-PM MCSs בגלל השפע שלהם, עם למעלה מ 1000 אנשי קשר לכל תא, טבע נשמרת שלהם כל אאוקריוטים. חשיפת חלבונים המהווים MCSs הוא קריטי כדי להבין כיצד תנועה שומנים נעשית בתאים, וכיצד הם פועלים כמו מולקולות איתות. מצאנו כי ER נקרא Scs2p למקם את ER-PM ו MCSs חשוב היווצרותם. אנו מתמקדים בחשיפת השותפים המולקולרי של Scs2p. זיהוי של קומפלקסים חלבונים מסורתי מסתמך על הראשון לפתרון דגימות חלבון מטוהרים על ידי ג&#39;ל אלקטרופורזה, ואחריו עיכול ג&#39;ל של להקות החלבון ואנליזה של פפטידים על ידי ספקטרומטריית מסה. זה לעתים קרובות מגביל את לימוד בקבוצה קטנה של חלבונים. כמו כן, קומפלקסים חלבונים נחשפים denaturing או לא תנאים פיזיולוגיים במהלך ההליך. כדי לעקוף את הבעיות הללו, יישמנו בקנה מידה גדול טכניקה proteomics כמותיים כדי לחלץ נתונים משוחדת לכמת. אנו משתמשים תיוג איזוטופ יציב עם חומצות אמינו תרבית תאים (SILAC) לשלב גרעינים איזוטופ מצרך חלבונים זן פקד לא מתוייגת. כמויות שוות של התרבות מתויג לא מתוייגת, תרבות SILAC שכותרתו מעורבבים יחד lysed על ידי שחיקה של חנקן נוזלי. לאחר מכן, אנו לבצע הליך טיהור זיקה לנתץ קומפלקסים חלבונים. לבסוף, אנו לזרז את המדגם חלבון, שהוא מוכן לניתוח על ידי כרומטוגרפיה ביצועים גבוהים נוזלי / ספקטרומטריית מסה טנדם. והחשוב מכל, חלבונים זן הבקרה מסומנים על ידי האיזוטופ הכבד יהיה לייצר שינוי מסה / מטען, כי ניתן לכמת נגד חלבונים ללא תווית בזן את הפיתיון. לכן, מזהמים, או מחייב נוקבים ניתן לבטל בקלות. על ידי שימוש בגישה זו, זיהינו חלבונים הרומן מספר למקם את ER-PM MCSs. כאן אנו מציגים תיאור מפורט של הגישה שלנו.

Watch this Scientific Journal Video about Identification of protein complexes with quantitative proteomics in S. cerevisiae at JoVE.com

Identification of protein complexes with quantitative proteomics in S. cerevisiae

כאן אנו מתארים טכניקה חדשה proteomics כמותיים לזיהוי מתחמי חלבון cerevisiae Saccharomyces. במחקר הנוכחי, השתמשנו בשיטה SILAC יחד עם טיהור זיקה ואחריו טנדם ספקטרומטריית מסה להזדהות עם סגוליות גבוהה השותפים המחייב של חלבון ER, Scs2p.

זיהוי של קומפלקסים חלבונים עם proteomics כמותיים cerevisiae ס

Lipids are the building blocks of cellular membranes that function as barriers and in compartmentalization of cellular processes, and recently, as ...

Research

JoVE Journal

Biology

Assay for Adhesion and Agar Invasion in S. cerevisiae

Assay עבור הידבקות ואת הפלישה אגר ב cerevisiae ס

Yeasts are found in natural biofilms, where many microorganisms colonize surfaces. In artificial environments, such as surfaces of man-made objects, ...

Proteomics to Identify Proteins Interacting with P2X2 Ligand-Gated Cation Channels

Proteomics כדי לזהות חלבונים אינטראקציה עם ליגנד P2X2-מגודרת ערוצי קטיון

Ligand-gated ion channels underlie synaptic communication in the nervous system1. In mammals there are three families of ligand-gated channels: the cys ...

A high-throughput method to globally study the organelle morphology in S. cerevisiae

שיטת תפוקה גבוהה ברחבי העולם כדי ללמוד את המורפולוגיה של אברון cerevisiae ס

High-throughput methods to examine protein localization or organelle morphology is an effective tool for studying protein interactions and can help ...

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

Phosphoproteomics כמותיים חומצת שומן מגורה Saccharomyces cerevisiae</em

This protocol describes the growth and stimulation, with the fatty acid oleate, of isotopically heavy and light S. cerevisiae cells. Cells are ground ...

Studying Age-dependent Genomic Instability using the S. cerevisiae Chronological Lifespan Model

Studying Age-dependent Genomic Instability using the S. cerevisiae Chronological Lifespan Model

לימוד גיל תלויי חוסר יציבות הגנום באמצעות ס cerevisiae דגם כרונולוגי תוחלת חיים

Studies using the Saccharomyces cerevisiae aging model have uncovered life span regulatory pathways that are partially conserved in higher eukaryotes1-2. ...

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

זיהוי של קומפלקסי חלבונים ב<em&gt; חיידקי Escherichia</em&gt; באמצעות טיהור זיקת פפטיד סדרתית בשילוב עם טנדם המוני ספקטרומטריית

Since most cellular processes are mediated by macromolecular assemblies, the systematic identification of protein-protein interactions (PPI) and the ...

Flow Cytometry-based Purification of S. cerevisiae Zygotes

Flow Cytometry-based Purification of S. cerevisiae Zygotes

טיהור הזרימה Cytometry מבוסס<em&gt; ס cerevisiae</em&gt; זיגוטות

Zygotes are essential intermediates between haploid and diploid states in the life cycle of many organisms, including yeast (Figure 1) 1. S. cerevisiae ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

הדמיה וניתוח של מולקולות ה-mRNA באמצעות הקרינה<em&gt; באתרו</em&gt; הכלאה ב<em&gt; Cerevisiae Saccharomyces</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

מבחני יחד לrefolding החלבון בניטור<em&gt; Cerevisiae Saccharomyces</em

Proteostasis, defined as the combined processes of protein folding/biogenesis, refolding/repair, and degradation, is a delicate cellular balance that must ...

Identification of Post-translational Modifications of Plant Protein Complexes

זיהוי לאחר translational השינויים של קומפלקסי חלבוני צמח

Plants adapt quickly to changing environments due to elaborate perception and signaling systems. During pathogen attack, plants rapidly respond to ...