Name: identification of protein complexes with quantitative proteomics in s. cerevisiae
Uploaded: 2009-03-04T00:00:00
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材料と方法<ol><li>酵母菌株<ul><li>本研究で使用したすべての菌株はBY4742背景に基づいています。 SILACのコントロール株（ マット、HIS3、LEU2、URA3、LYS2とarg4に：：G418は）：BY4742（マットアルファ、にarg4に欠失株（G418：マット、HIS3、URA3、LEU2、arg4は対象を ）交配することにより行われたHIS3、LEU2、URA3とLYS2）、および減数分裂半数体は四分子解剖によって得られた。?...

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	<li>Loewen, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inheritance+of+cortical+ER+in+yeast+is+required+for+normal+septin+organization.">Inheritance of cortical ER in yeast is required for normal septin organization.</a> Jour. Cell Biol. 179, 467-483 .</li><li>Ong, S., Foster, L. J., Hoog, C. L., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+spectrometric-based+approaches+in+quantitative+proteomics.">Mass spectrometric-based approaches in quantitative proteomics.</a> Methods. 29, 124-130 .</li><li>Puig, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Tandem+Affinity+Purification+(TAP)+method:+a+general+procedure+of+protein+complex+purification.">The Tandem Affinity Purification (TAP) method: a general procedure of protein complex purification.</a> Methods. 24, 218-229 .</li><li>Amberg, D. C., Burke, D. J., Strathern, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+in+Yeast+Genetics.">Methods in Yeast Genetics.</a> , 123-125 .</li></ol>

精製処理中に保存さアリコートは、（1）事前に清澄化細胞ライセート、（2）結合画分、（3）非結合画分、および（4）溶出画分を含める必要があります。我々は、実験の結合と溶出効率を反映するために抗TAP抗体または銀染色を用いてウェスタンブロッティングにより上記アリコートの濃度のタンパク質を分析することをお勧めします。銀染色したゲルとブロットの例を図1に示されていま?...

identification of protein complexes with quantitative proteomics in s. cerevisiae

脂質は細胞膜のビルディングブロックの障壁として及び細胞プロセスの区画で、そして最近では、重要な細胞内シグナル伝達分子として機能です。しかし、タンパク質とは異なり、脂質は主に膜の接触部位（MCSの）で起こると仮定しているが不十分で説明非小胞性の経路によって小さな疎水性分子は、トラフィックです。 MCSのは、小胞体（ER）は提携細胞小器官、例えば、細胞膜（PM）との直接的な物理的接触を行う領域です。 ER - PM MCSのER部分は、その脂質の合成は、これらのサイトにリダイレクトし、MCSのは脂質のトラフィックのために重要であることを意味しているを示唆し、脂質合成酵素に富んでいる。酵母は、1000種類以上の細胞あたりの連絡先、およびすべての真核生物におけるそれらの保存された自然と、ために彼らの豊かなER - PM MCSを研究する理想的なモデルです。 MCSを構成するタンパク質を明らかにする脂質のトラフィックは細胞内でどのように達成されるかを理解する上で重要な、そしてそれらがどのようにシグナル伝達分子として作用です。我々はScs2pと呼ばれるERは、ER - PMのMCSのに局在することを発見し、その形成に重要ですしている。我々はScs2pの分子のパートナーを発掘に重点を置いています。タンパク質複合体の同定は、伝統的に質量分析法によるタンパク質のバンドやペプチドの分析のゲル内消化に続いて、最初にゲル電気泳動によって精製したタンパク質サンプルを解決することに依存しています。これは、しばしばタンパク質の小さなサブセットに調査を制限します。また、タンパク質複合体は、手順の間に変性または非生理的な条件にさらされている。これらの問題を回避するために、我々は公平と定量データを抽出するために大規模な定量的プロテオミクスの手法を実装している。我々は、タグの付いていない対照菌株中のタンパク質にステープル同位体の原子核を組み込むために細胞培養におけるアミノ酸（SILAC）と安定同位体標識法を使用してください。タグ付けされた文化とタグなし、SILAC標識文化の等量を混合し、液体窒素中で粉砕することにより溶解されています。私たちは、その後、タンパク質複合体をプルダウンするアフィニティー精製の手順を実行します。最後に、我々は、高速液体クロマトグラフィー/タンデム質量分析法による分析のための準備ができているタンパク質試料を、沈殿させる。最も重要なことは、対照株のタンパク質は、重い同位体で標識し、餌の株では非標識蛋白質に対する定量することができる質量/電荷シフトを生成します。したがって、汚染物質、または非特異的な結合を容易に除去することができます。このアプローチを使用することによって、我々は、ER - PMのMCSのためにローカライズするいくつかの新規タンパク質を同定した。ここでは、我々のアプローチの詳細な説明を提示する。

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Identification of protein complexes with quantitative proteomics in S. cerevisiae

ここでは、出芽酵母でのタンパク質複合体を識別するための新しい定量的プロテオミクスの手法を説明します。本研究では、我々は、高い特異性でERタンパク質、Scs2pの結合パートナーを同定するためにタンデム質量分析が続くアフィニティー精製と一緒にSILACメソッドを使用している。

S. cerevisiaeの定量的プロテオミクスとタンパク質の複合体の同定

Lipids are the building blocks of cellular membranes that function as barriers and in compartmentalization of cellular processes, and recently, as ...

Research

JoVE Journal

Biology

Assay for Adhesion and Agar Invasion in S. cerevisiae

S. cerevisiaeの接着と寒天の侵略のためのアッセイ

Yeasts are found in natural biofilms, where many microorganisms colonize surfaces. In artificial environments, such as surfaces of man-made objects, ...

Proteomics to Identify Proteins Interacting with P2X2 Ligand-Gated Cation Channels

P2X2リガンド依存性陽イオンチャネルと相互作用するタンパク質を特定するためのプロテオミクス

Ligand-gated ion channels underlie synaptic communication in the nervous system1. In mammals there are three families of ligand-gated channels: the cys ...

A high-throughput method to globally study the organelle morphology in S. cerevisiae

グローバルS. cerevisiaeの細胞小器官の形態を研究するためにハイスループット法

High-throughput methods to examine protein localization or organelle morphology is an effective tool for studying protein interactions and can help ...

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

脂肪酸の定量的なPhosphoproteomicsは刺激を受けてサッカロマイセスセレビシエ</em

This protocol describes the growth and stimulation, with the fatty acid oleate, of isotopically heavy and light S. cerevisiae cells. Cells are ground ...

Studying Age-dependent Genomic Instability using the S. cerevisiae Chronological Lifespan Model

Studying Age-dependent Genomic Instability using the S. cerevisiae Chronological Lifespan Model

使用年齢に依存するゲノム不安定性を研究して S.出芽酵母時系列寿命モデル

Studies using the Saccharomyces cerevisiae aging model have uncovered life span regulatory pathways that are partially conserved in higher eukaryotes1-2. ...

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

のタンパク質複合体の同定<em&gt;大腸菌</em&gt;タンデム質量分析との組み合わせでシーケンシャルペプチドアフィニティ精製を用いた

Since most cellular processes are mediated by macromolecular assemblies, the systematic identification of protein-protein interactions (PPI) and the ...

Flow Cytometry-based Purification of S. cerevisiae Zygotes

Flow Cytometry-based Purification of S. cerevisiae Zygotes

のフローサイトメトリーベースの精製<em&gt; S.セレビ</em&gt;受精卵

Zygotes are essential intermediates between haploid and diploid states in the life cycle of many organisms, including yeast (Figure 1) 1. S. cerevisiae ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

蛍光を用いたmRNA分子の可視化と分析<em&gt;その場で</emで&gt;ハイブリダイゼーション<em&gt;サッカロミセス·セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

のリフォールディング監視タンパク質を結合アッセイ<em&gt;サッカロミセス·セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）</em

Proteostasis, defined as the combined processes of protein folding/biogenesis, refolding/repair, and degradation, is a delicate cellular balance that must ...

Identification of Post-translational Modifications of Plant Protein Complexes

植物タンパク質複合体の翻訳後修飾の同定

Plants adapt quickly to changing environments due to elaborate perception and signaling systems. During pathogen attack, plants rapidly respond to ...