Name: identification of protein complexes with quantitative proteomics in s. cerevisiae
Uploaded: 2009-03-04T00:00:00
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재료 및 방법 <ol><li> 효모 종자 <ul><li> 이 연구에 사용된 모든 종자는 BY4742 배경에 근거하고 있습니다. SILAC 제어 스트레인 (매트, his3, leu2, ura3, lys2 및 arg4 : G418)는 : BY4742 (매트 알파에 arg4 삭제 스트레인 (G418 : 매트, his3, ura3, leu2 및 arg4)를 교배에 의해 만들어진 his3, leu2, ura3 및 lys2) 및 meiotic haploids는 tetrad 절개로 얻은되었습니다. 따라서, 제어 변형은 라이신과 아르기닌?...

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	<li>Loewen, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inheritance+of+cortical+ER+in+yeast+is+required+for+normal+septin+organization.">Inheritance of cortical ER in yeast is required for normal septin organization.</a> Jour. Cell Biol. 179, 467-483 .</li><li>Ong, S., Foster, L. J., Hoog, C. L., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+spectrometric-based+approaches+in+quantitative+proteomics.">Mass spectrometric-based approaches in quantitative proteomics.</a> Methods. 29, 124-130 .</li><li>Puig, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Tandem+Affinity+Purification+(TAP)+method:+a+general+procedure+of+protein+complex+purification.">The Tandem Affinity Purification (TAP) method: a general procedure of protein complex purification.</a> Methods. 24, 218-229 .</li><li>Amberg, D. C., Burke, D. J., Strathern, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+in+Yeast+Genetics.">Methods in Yeast Genetics.</a> , 123-125 .</li></ol>

정화 절차를 수행하는 동안 저장된 aliquots (1) 사전 허가 세포 lysate, (2) 바운드 분수 (3) 언바운드 분율, 그리고 (4) eluted 소수를 포함해야합니다. 우리는 실험의 바인딩과 eluting 효율성을 반영하기 위해 안티 - TAP 항체 또는 실버 얼룩을 사용하여 모래 바닥 서양하여 위의 aliquots의 단백질 내용을 분석하는 것이 좋습니다. 은색 스테인드 젤과 얼룩의 예는 그림 1에 표시됩니다. SIL...

identification of protein complexes with quantitative proteomics in s. cerevisiae

Lipids 중요한 세포 신호 전달 분자로, 최근에는 장벽로서 세포 프로세스 compartmentalization에서 세포 세포막 그 함수의 빌딩 블록이며,. 그러나, 단백질과는 달리, lipids 작은 소수성 분자는 것을 주로 막 연락처 사이트 (MCSs)에서 발생하는 가상 아르 제대로 설명 nonvesicular 경로로 트래픽. MCSs는 endoplasmic reticulum (ER)가 제휴 organelle, 예를 들어, 플라즈마 멤브레인 (PM)와 직접적인 신체 접촉을 만드는 지역입니다. ER - PM MCSs의 ER 부분은 그 지질 합성이 해당 사이트로 이동하고 MCSs는 지질 트래픽 중요하다는 것을 뜻합니다 제안, 지질 합성 효소에 풍부합니다. 효모는 1000 셀 당 연락처 및 모든 eukaryotes에서 보존 자연과, 때문에 그들의 풍요의 ER - PM MCSs를 공부하는 이상적인 모델입니다. MCSs을 구성하는 단백질을 잠복하면 lipids 트래픽이 세포에 달성하는 방법 이해하는 것이 중요합니다, 그들은 신호 분자 역할을하는 방법. 우리는 Scs2p라는 ER은 ER - 오후 MCSs에 집중 발견과 형성에 중요합니다. 우리는 Scs2p의 분자 파트너 잠복에 초점을 맞추고 있습니다. 단백질 단지의 확인은 전통적으로 첫번째 질량 분광법에 의해 펩티드의 단백질 밴드와 분석에 - 젤 소화 다음 겔 전기 영동에 의해 정제된 단백질 샘플을 해결에 의존합니다. 이것은 종종 단백질의 작은 하위 집합에 대한 연구를 제한합니다. 또한, 단백질 단지는 절차를 수행하는 동안 denaturing 또는 이외의 생리 조건에 노출되어 있습니다. 이러한 문제를 회피하기 위해, 우리는 편견과 계량 데이터를 추출하기 위해 대규모 양적 proteomics 기술을 구현했습니다. 우리는 태그가 지정되지 않은 제어 변형에 단백질의 주요 동위 원소의 핵을 통합하기 위해 세포 배양에서 아미노산 (SILAC)와 안정 동위 원소 라벨을 사용합니다. 태그 문화와 태그가 지정되지 않은, SILAC - 레이블 문화의 동등 권 함께 혼합하여 액체 질소에 연삭에 의해 lysed 있습니다. 그러면 단백질 단지를 잡아 친화 정화 절차를 수행합니다. 마지막으로, 우리는 고성능 액체 크로마 토그래피 / 탠덤 질량 분석계로 분석을위한 준비가 단백질 샘플을 촉진. 가장 중요한 것은, 제어 변형에 단백질은 무거운 동위 원소에 의해 표시되고 미끼 변형에 레이블이 지정되지 않은 단백질에 대한 계량 수있는 질량 / 비용 변화를 생산합니다. 따라서, 오염 물질, 또는 unspecific 바인딩을 쉽게 제거하실 수 있습니다. 이 접근법을 사용함으로써, 우리는 ER - 오후 MCSs에 집중 여러 소설 단백질을 발견했습니다. 여기 우리는 우리의 접근 방법에 대한 자세한 설명을 제시한다.

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Identification of protein complexes with quantitative proteomics in S. cerevisiae

여기 Saccharomyces cerevisiae의에서 단백질 단지를 식별하기위한 새로운 양적 proteomics 기술을 설명합니다. 본 연구에서는, 우리는 높은 특이성과 ER 단백질 Scs2p의 바인딩 파트너를 식별하는 탠덤 질량 분석계 다음 친화 정화와 함께 SILAC 방법을 사용했습니다.

S. cerevisiae의의 양적 proteomics와 단백질 단지의 식별

Lipids are the building blocks of cellular membranes that function as barriers and in compartmentalization of cellular processes, and recently, as ...

Research

JoVE Journal

Biology

Assay for Adhesion and Agar Invasion in S. cerevisiae

S. cerevisiae의의 접착 및 아가르 침략을위한 분석

Yeasts are found in natural biofilms, where many microorganisms colonize surfaces. In artificial environments, such as surfaces of man-made objects, ...

연구

생물학

Proteomics to Identify Proteins Interacting with P2X2 Ligand-Gated Cation Channels

P2X2 리간드 - 게이 티드 양이온 채널과 상호 작용하는 단백질을 확인하는 Proteomics

Ligand-gated ion channels underlie synaptic communication in the nervous system1. In mammals there are three families of ligand-gated channels: the cys ...

A high-throughput method to globally study the organelle morphology in S. cerevisiae

세계 S. cerevisiae의에서 organelle 형태를 연구하기 위해 높은 처리량 방법

High-throughput methods to examine protein localization or organelle morphology is an effective tool for studying protein interactions and can help ...

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

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지방산의 정량 Phosphoproteomics은 자극 Saccharomyces cerevisiae</em

This protocol describes the growth and stimulation, with the fatty acid oleate, of isotopically heavy and light S. cerevisiae cells. Cells are ground ...

Studying Age-dependent Genomic Instability using the S. cerevisiae Chronological Lifespan Model

Studying Age-dependent Genomic Instability using the S. cerevisiae Chronological Lifespan Model

를 사용하여 연령에 의존 게놈의 불안정성 유학 S. cerevisiae 연대기 수명 모델

Studies using the Saccharomyces cerevisiae aging model have uncovered life span regulatory pathways that are partially conserved in higher eukaryotes1-2. ...

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

의 단백질 단지의 식별<em&gt; 대장균</em&gt; 직렬 질량 분석법과 함께 순차적 펩타이드의 동질 정화를 사용하여

Since most cellular processes are mediated by macromolecular assemblies, the systematic identification of protein-protein interactions (PPI) and the ...

Flow Cytometry-based Purification of S. cerevisiae Zygotes

Flow Cytometry-based Purification of S. cerevisiae Zygotes

의 흐름 세포 계측법 기반 정화<em&gt; S. cerevisiae</em&gt; Zygotes

Zygotes are essential intermediates between haploid and diploid states in the life cycle of many organisms, including yeast (Figure 1) 1. S. cerevisiae ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

형광을 사용하여 mRNA의 분자의 시각화 및 분석<em&gt; 제자리에서</em에서&gt; 하이브리드<em&gt; 사카 cerevisiae의</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

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의 모니터링 단백질 접힘에 대한 결합 분석 실험<em&gt; 사카 cerevisiae의</em

Proteostasis, defined as the combined processes of protein folding/biogenesis, refolding/repair, and degradation, is a delicate cellular balance that must ...

Identification of Post-translational Modifications of Plant Protein Complexes

식물 단백질 복합체의 번역 후 변형의 확인

Plants adapt quickly to changing environments due to elaborate perception and signaling systems. During pathogen attack, plants rapidly respond to ...