Name: identification of protein complexes with quantitative proteomics in s. cerevisiae
Uploaded: 2009-03-04T00:00:00
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Materiais e Métodos <ol><li> Cepas de leveduras <ul><li> Todas as cepas utilizadas neste estudo são baseados no fundo BY4742. Da estirpe do controlo SILAC (Mat a, his3, leu2, ura3, lys2 e arg4:: G418) foi feita por meio de cruzamentos arg4 tensão exclusão (Mat a, his3, ura3, leu2 e arg4:: G418) para BY4742 (Mat alfa, his3, leu2, ura3 e lys2), e as haplóides meióticas foram obtidas por dissecção tétrade. Portanto, a tensão de controle é um auxotroph de lisina e arginina. A...

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	<li>Loewen, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inheritance+of+cortical+ER+in+yeast+is+required+for+normal+septin+organization.">Inheritance of cortical ER in yeast is required for normal septin organization.</a> Jour. Cell Biol. 179, 467-483 .</li><li>Ong, S., Foster, L. J., Hoog, C. L., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+spectrometric-based+approaches+in+quantitative+proteomics.">Mass spectrometric-based approaches in quantitative proteomics.</a> Methods. 29, 124-130 .</li><li>Puig, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Tandem+Affinity+Purification+(TAP)+method:+a+general+procedure+of+protein+complex+purification.">The Tandem Affinity Purification (TAP) method: a general procedure of protein complex purification.</a> Methods. 24, 218-229 .</li><li>Amberg, D. C., Burke, D. J., Strathern, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+in+Yeast+Genetics.">Methods in Yeast Genetics.</a> , 123-125 .</li></ol>

As alíquotas salvo durante o processo de purificação deve incluir (1) lisado celular pré-limpo, (2) fração ligada, (3) fracção livre, e (4) fração eluída. Recomendamos analisar o conteúdo de proteína das alíquotas acima por Western blotting utilizando anticorpo anti-TAP ou coloração pela prata para refletir a eficiência de ligação e eluição do experimento. Exemplos de um gel de prata manchada e uma mancha são mostrados na Figura 1. Desde SILAC nos fornece medições imp...

identification of protein complexes with quantitative proteomics in s. cerevisiae

Lipídios são os blocos de construção das membranas celulares que funcionam como barreiras e na compartimentalização de processos celulares e, recentemente, como importantes moléculas sinalizadoras intracelulares. No entanto, ao contrário de proteínas, lipídios são pequenas moléculas hidrofóbicas que o tráfego principalmente pelo mal descritos rotas não vesiculares, que são a hipótese de ocorrer em locais de contato da membrana (MCS). MCS são regiões onde o retículo endoplasmático (ER) faz o contato físico direto com uma organela parceria, por exemplo, membrana plasmática (PM). A porção de ER ER-PM MCS é enriquecida em lipídios, síntese de enzimas, sugerindo que a síntese lipídica é direcionado para esses sites e dando a entender que SMCs são importantes para o tráfego de lipídios. A levedura é um modelo ideal para estudar ER-PM SMCs por causa de sua abundância, com mais de 1.000 contatos por celular, e sua natureza preservada em todos os eucariontes. Descobrindo as proteínas que constituem MCS é fundamental para a compreensão de como o tráfego de lipídios é realizada nas células, e como eles agem como moléculas de sinalização. Descobrimos que uma ER chamado Scs2p localizar a ER-PM MCS e é importante para sua formação. Estamos focados em descobrir os parceiros moleculares da Scs2p. Identificação de complexos de proteínas tradicionalmente se baseia em primeiro resolver amostras de proteínas purificadas por eletroforese em gel, seguido por in-gel a digestão de bandas de proteínas e análise de peptídeos por espectrometria de massa. Isso muitas vezes limita o estudo a um pequeno subconjunto de proteínas. Além disso, complexos de proteínas são expostas a desnaturação ou condições não fisiológicas durante o procedimento. Para contornar esses problemas, temos implementado um grande escala técnica proteômica quantitativa para extrair dados imparciais e quantificados. Usamos rotulagem isótopo estável com aminoácidos em cultura de células (SILAC) para incorporar os núcleos de isótopos grampo em proteínas em uma estirpe de controlo untagged. Volumes iguais de cultura marcados e não marcados cultura, SILAC-rotulados são misturados e lisadas por moagem em nitrogênio líquido. Em seguida, realizar um processo de purificação de afinidade para puxar para baixo complexos de proteína. Finalmente, precipitar a amostra de proteína, que está pronto para análise por cromatografia líquida / espectrometria de massa tandem. Mais importante ainda, proteínas em uma estirpe de controlo são rotulados pela isótopo pesado e produzirá uma mudança em massa / carga que pode ser quantificado contra as proteínas não marcado na cepa isca. Portanto, contaminantes, ou ligação inespecífica pode ser facilmente eliminada. Usando essa abordagem, identificamos várias novas proteínas que localizar a ER-PM MCS. Aqui nós apresentamos uma descrição detalhada da nossa abordagem.

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Identification of protein complexes with quantitative proteomics in S. cerevisiae

Aqui nós descrevemos uma nova técnica proteômica quantitativa para a identificação de complexos de proteína em Saccharomyces cerevisiae. Neste estudo, nós utilizamos o método SILAC juntamente com purificação de afinidade seguido por espectrometria de massa para identificar com alta especificidade dos parceiros de ligação de uma proteína ER, Scs2p.

Identificação de complexos de proteínas com proteômica quantitativa em S. cerevisiae

Lipids are the building blocks of cellular membranes that function as barriers and in compartmentalization of cellular processes, and recently, as ...

Research

JoVE Journal

Biology

Assay for Adhesion and Agar Invasion in S. cerevisiae

Ensaio para a Adesão e Invasão Agar em S. cerevisiae

Yeasts are found in natural biofilms, where many microorganisms colonize surfaces. In artificial environments, such as surfaces of man-made objects, ...

Biologia

Proteomics to Identify Proteins Interacting with P2X2 Ligand-Gated Cation Channels

Proteômica para identificar proteínas Interagindo com P2X2 Canais Ligand-Gated Cation

Ligand-gated ion channels underlie synaptic communication in the nervous system1. In mammals there are three families of ligand-gated channels: the cys ...

A high-throughput method to globally study the organelle morphology in S. cerevisiae

Um método de alto rendimento para estudar a morfologia global organela em S. cerevisiae

High-throughput methods to examine protein localization or organelle morphology is an effective tool for studying protein interactions and can help ...

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

Phosphoproteomics quantitativa em ácidos graxos estimulada Saccharomyces cerevisiae</em

This protocol describes the growth and stimulation, with the fatty acid oleate, of isotopically heavy and light S. cerevisiae cells. Cells are ground ...

Studying Age-dependent Genomic Instability using the S. cerevisiae Chronological Lifespan Model

Studying Age-dependent Genomic Instability using the S. cerevisiae Chronological Lifespan Model

Estudando Idade-dependente Instabilidade Genômica usando o S. cerevisiae Modelo Lifespan cronológica

Studies using the Saccharomyces cerevisiae aging model have uncovered life span regulatory pathways that are partially conserved in higher eukaryotes1-2. ...

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Identificação de complexos de proteínas em<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Utilizando a purificação por afinidade sequencial Peptide em combinação com espectrometria de massa tandem

Since most cellular processes are mediated by macromolecular assemblies, the systematic identification of protein-protein interactions (PPI) and the ...

Flow Cytometry-based Purification of S. cerevisiae Zygotes

Flow Cytometry-based Purification of S. cerevisiae Zygotes

Purificação Citometria de Fluxo com base em<em&gt; S. cerevisiae</em&gt; Zigotos

Zygotes are essential intermediates between haploid and diploid states in the life cycle of many organisms, including yeast (Figure 1) 1. S. cerevisiae ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

Visualização e análise de moléculas de mRNA Usando Fluorescência<em&gt; In Situ</em&gt; A hibridação em<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

Ensaios para Monitoramento juntamente redobramento de proteínas em<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Proteostasis, defined as the combined processes of protein folding/biogenesis, refolding/repair, and degradation, is a delicate cellular balance that must ...

Identification of Post-translational Modifications of Plant Protein Complexes

Identificação de modificações pós-translacionais de Complexos de proteína vegetal

Plants adapt quickly to changing environments due to elaborate perception and signaling systems. During pathogen attack, plants rapidly respond to ...