Name: identification of protein complexes with quantitative proteomics in s. cerevisiae
Uploaded: 2009-03-04T00:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Identification of protein complexes with quantitative proteomics in S. cerevisiae at JoVE.com

Материалы и методы <ol><li> Штаммов дрожжей <ul><li> Все штаммы, используемые в настоящем исследовании, основаны на BY4742 фоне. Напряжение SILAC контроля (Мат, his3, leu2, URA3, lys2 и arg4:: G418) был сделан в результате скрещивания arg4 удаление штамма (Мат, his3, URA3, leu2 и arg4:: G418), чтобы BY4742 (Мф. альфа, hi...

<ol>
	<li>Loewen, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inheritance+of+cortical+ER+in+yeast+is+required+for+normal+septin+organization.">Inheritance of cortical ER in yeast is required for normal septin organization.</a> Jour. Cell Biol. 179, 467-483 .</li><li>Ong, S., Foster, L. J., Hoog, C. L., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+spectrometric-based+approaches+in+quantitative+proteomics.">Mass spectrometric-based approaches in quantitative proteomics.</a> Methods. 29, 124-130 .</li><li>Puig, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Tandem+Affinity+Purification+(TAP)+method:+a+general+procedure+of+protein+complex+purification.">The Tandem Affinity Purification (TAP) method: a general procedure of protein complex purification.</a> Methods. 24, 218-229 .</li><li>Amberg, D. C., Burke, D. J., Strathern, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+in+Yeast+Genetics.">Methods in Yeast Genetics.</a> , 123-125 .</li></ol>

Аликвоты сохраняются при очистке процедуры должны включать в себя (1) предварительно очищен Клеточный лизат, (2) связанной фракции, (3) несвязанные фракции, и (4) элюировали фракцию. Мы рекомендуем проанализировать содержание белка выше аликвоты западных промокательной с использованием а...

identification of protein complexes with quantitative proteomics in s. cerevisiae

Липиды являются строительным материалом клеточных мембран, которые функционируют как барьеров и дробления клеточных процессов, а в последнее время, в качестве важных внутриклеточных сигнальных молекул. Однако, в отличие от белков, липидов небольшие гидрофобные молекулы, что трафик прежде всего плохо описываются nonvesicular маршрутов, которые предположили, происходит на мембранных контактов сайтов (СМКС). СМКС регионы, где эндоплазматический ретикулум (ER) делает прямого физического контакта с партнерских органелл, например, плазматической мембраны (ПМ). ER часть ЭР-ПМ СМКС обогащается липидами синтеза ферментов, предполагая, что синтез липидов направлена ​​на эти сайты и подразумевая, что СМКС важны для липидной трафика. Дрожжи идеальной моделью для изучения ЭР-ПМ СМКС из-за их изобилия, с более чем 1000 контактов в клетке, и их сохранения природы во всех эукариот. Раскрытие белки, которые составляют СМКС имеет решающее значение для понимания того, как липиды трафика осуществляется в клетках, и как они действуют в качестве сигнальных молекул. Мы обнаружили, что ER называется Scs2p локализовать к ER-ПМ СМКС и имеет важное значение для их формирования. Мы ориентированы на выявление молекулярно партнеров Scs2p. Идентификация белковых комплексов традиционно основывается на решении первой очищенных образцов белка помощью гель-электрофореза, а затем в-гель переваривание белка полосы и анализа пептидов, масс-спектрометрии. Это часто ограничивает исследования небольшой группы белков. Кроме того, белковые комплексы подвергаются денатурации или не-физиологических условиях во время процедуры. Чтобы обойти эти проблемы, мы осуществили крупномасштабные количественные техники протеомики для извлечения объективной и количественных данных. Мы используем стабильные маркировки изотопа с аминокислотами в культуре клеток (SILAC) включить основных ядер изотопа в белки в немаркированные напряжение управления. Равные объемы меченых культуры и немаркированные, SILAC меченных культуры смешиваются и лизированных путем измельчения в жидком азоте. Затем проводят процедуры аффинной очистки снести белковых комплексов. Наконец, мы осадок белка образца, который готов для анализа высокопроизводительной жидкостной хроматографии / тандемной масс-спектрометрии. Самое главное, белки контрольного штамма помечены тяжелого изотопа и будет производить масса / заряд сдвиг, который может быть определена количественно против немеченого белков в приманку напряжения. Таким образом, загрязнители, или неспецифических связывание может быть легко устранена. Используя этот подход, мы выделили несколько белков, роман, который локализуется ЭР-ПМ СМКС. Здесь мы приводим подробное описание нашего подхода.

Watch this Scientific Journal Video about Identification of protein complexes with quantitative proteomics in S. cerevisiae at JoVE.com

Identification of protein complexes with quantitative proteomics in S. cerevisiae

Здесь мы опишем новые количественные техники протеомики для идентификации белковых комплексов в CEREVISIAE Saccharomyces. В данном исследовании мы использовали метод SILAC вместе с аффинной очистки следует тандемной масс-спектрометрии для определения с высокой специфичностью обязательными партнерами ER белков, Scs2p.

Идентификация белковых комплексов с количественной протеомики в CEREVISIAE С.

Lipids are the building blocks of cellular membranes that function as barriers and in compartmentalization of cellular processes, and recently, as ...

Research

JoVE Journal

Biology

Assay for Adhesion and Agar Invasion in S. cerevisiae

Анализ для адгезии и агар Вторжение в CEREVISIAE С.

Yeasts are found in natural biofilms, where many microorganisms colonize surfaces. In artificial environments, such as surfaces of man-made objects, ...

Proteomics to Identify Proteins Interacting with P2X2 Ligand-Gated Cation Channels

Протеомики для идентификации белков Взаимодействие с P2X2 лиганд-Gated Каналы Катионит

Ligand-gated ion channels underlie synaptic communication in the nervous system1. In mammals there are three families of ligand-gated channels: the cys ...

A high-throughput method to globally study the organelle morphology in S. cerevisiae

Высокой пропускной метод глобально исследования морфологии органелл в CEREVISIAE С.

High-throughput methods to examine protein localization or organelle morphology is an effective tool for studying protein interactions and can help ...

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

Количественные Phosphoproteomics в жирные кислоты Вынужденное Saccharomyces CEREVISIAE</em

This protocol describes the growth and stimulation, with the fatty acid oleate, of isotopically heavy and light S. cerevisiae cells. Cells are ground ...

Studying Age-dependent Genomic Instability using the S. cerevisiae Chronological Lifespan Model

Studying Age-dependent Genomic Instability using the S. cerevisiae Chronological Lifespan Model

Изучение, зависящими от возраста геномной нестабильности использованием С. CEREVISIAE Хронологические Модель продолжительность жизни

Studies using the Saccharomyces cerevisiae aging model have uncovered life span regulatory pathways that are partially conserved in higher eukaryotes1-2. ...

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Определение белковых комплексов в<em&gt; Кишечной палочки</em&gt; С помощью последовательного аффинной очистки пептидов в сочетании с тандемной масс-спектрометрии

Since most cellular processes are mediated by macromolecular assemblies, the systematic identification of protein-protein interactions (PPI) and the ...

Flow Cytometry-based Purification of S. cerevisiae Zygotes

Flow Cytometry-based Purification of S. cerevisiae Zygotes

Проточной цитометрии на основе очистки<em&gt; S. CEREVISIAE</em&gt; Зиготы

Zygotes are essential intermediates between haploid and diploid states in the life cycle of many organisms, including yeast (Figure 1) 1. S. cerevisiae ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

Визуализации и анализа молекул мРНК с помощью флуоресцентной<em&gt; В Ситу</em&gt; Гибридизация в<em&gt; Saccharomyces CEREVISIAE</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

В сочетании Анализы для мониторинга рефолдинг Белок в<em&gt; Saccharomyces CEREVISIAE</em

Proteostasis, defined as the combined processes of protein folding/biogenesis, refolding/repair, and degradation, is a delicate cellular balance that must ...

Identification of Post-translational Modifications of Plant Protein Complexes

Идентификация пост-трансляционных модификаций растительных белковых комплексов

Plants adapt quickly to changing environments due to elaborate perception and signaling systems. During pathogen attack, plants rapidly respond to ...