Name: identification of protein complexes with quantitative proteomics in s. cerevisiae
Uploaded: 2009-03-04T00:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Identification of protein complexes with quantitative proteomics in S. cerevisiae at JoVE.com

Materiales y Métodos <ol><li> Cepas de levadura <ul><li> Todas las cepas utilizadas en este estudio se basan en el fondo BY4742. La cepa de control SILAC (Mat uno, his3, leu2, ura3, LYS2 y arg4:: G418) se hizo en el apareamiento arg4 supresión cepa (Mat uno, HIS3, URA3, leu2 y arg4:: G418) a BY4742 (Mat alfa, his3, leu2, ura3 y LYS2), y los haploides meiótica se obtuvieron por disección tétrada. Por lo tanto, la tensión de control es una auxótrofo de lisina y arginina. La cep...

<ol>
	<li>Loewen, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inheritance+of+cortical+ER+in+yeast+is+required+for+normal+septin+organization.">Inheritance of cortical ER in yeast is required for normal septin organization.</a> Jour. Cell Biol. 179, 467-483 .</li><li>Ong, S., Foster, L. J., Hoog, C. L., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+spectrometric-based+approaches+in+quantitative+proteomics.">Mass spectrometric-based approaches in quantitative proteomics.</a> Methods. 29, 124-130 .</li><li>Puig, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Tandem+Affinity+Purification+(TAP)+method:+a+general+procedure+of+protein+complex+purification.">The Tandem Affinity Purification (TAP) method: a general procedure of protein complex purification.</a> Methods. 24, 218-229 .</li><li>Amberg, D. C., Burke, D. J., Strathern, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+in+Yeast+Genetics.">Methods in Yeast Genetics.</a> , 123-125 .</li></ol>

Las alícuotas guardado durante el procedimiento de purificación que incluyen (1) pre-aprobados lisado celular, (2) fracción unida, (3) fracción libre, y (4) fracción eluida. Le recomendamos analizar el contenido de proteínas de las alícuotas anteriormente por Western Blot utilizando anticuerpos anti-TAP o tinción de plata para reflejar la eficacia vinculante y liberadores del experimento. Ejemplos de un gel de plata de colores y una mancha se muestra en la Figura 1. Desde SILAC nos p...

identification of protein complexes with quantitative proteomics in s. cerevisiae

Los lípidos son los componentes de las membranas celulares que funcionan como barreras y en la compartimentación de los procesos celulares, y recientemente, como importantes moléculas de señalización intracelular. Sin embargo, a diferencia de las proteínas, los lípidos son pequeñas moléculas hidrofóbicas que el tráfico sobre todo por el mal descrito rutas nonvesicular, que son la hipótesis de que se produzca en los sitios de contacto con la membrana (MCS). MCS son las regiones donde el retículo endoplasmático (ER) se pone en contacto físico directo con una asociación orgánulos, por ejemplo, la membrana plasmática (PM). La porción de ER ER-PM MCS se enriquece en la síntesis de lípidos, enzimas, lo que sugiere que la síntesis de lípidos se dirige a estos sitios y lo que implica que los SCM son importantes para el tráfico de lípidos. La levadura es un modelo ideal para estudiar ER-PM MCS debido a su abundancia, con más de 1.000 contactos por celular, y su naturaleza se conserva en todos los eucariotas. Descubrimiento de las proteínas que constituyen la MCS es fundamental para la comprensión de cómo el tráfico de lípidos se lleva a cabo en las células, y la forma en que actúan como moléculas de señalización. Hemos encontrado que una llamada ER Scs2p localizar a ER-PM MCS y es importante para su formación. Nos hemos centrado en el descubrimiento de los socios de Scs2p molecular. Identificación de los complejos de proteínas tradicionalmente se basa en la primera resolución de muestras purificadas de proteínas por electroforesis en gel, seguido por la digestión en gel de bandas de proteínas y el análisis de los péptidos mediante espectrometría de masas. A menudo, esto limita el estudio a un pequeño subconjunto de proteínas. Además, los complejos de proteínas están expuestos a la desnaturalización o condiciones no fisiológicas durante el procedimiento. Para evitar estos problemas, hemos puesto en marcha una técnica de gran escala proteómica cuantitativa para extraer datos imparciales y cuantificados. Usamos el etiquetado de isótopos estables con aminoácidos en cultivo celular (SILAC) para incorporar los núcleos de isótopos de primera necesidad en las proteínas de una cepa control sin etiquetar. Volúmenes iguales de la cultura de etiqueta y sin etiqueta, cultura SILAC marcado se mezclan y se lisaron por molienda en nitrógeno líquido. A continuación, llevar a cabo un procedimiento de purificación de la afinidad para tirar hacia abajo los complejos de proteínas. Por último, se precipitan las proteínas de la muestra, que está listo para su análisis por cromatografía líquida de alta resolución / espectrometría de masas en tándem. Más importante aún, las proteínas de la cepa de control están marcados por el isótopo pesado y producirá un cambio de masa / carga que se puede cuantificar en contra de las proteínas sin marcar en la cepa de cebo. Por lo tanto, los contaminantes, o la unión no específica se pueden eliminar fácilmente. Con este enfoque, se han identificado varias proteínas nuevas que se localizan en el ER-PM MCS. Aquí se presenta una descripción detallada de nuestro enfoque.

Watch this Scientific Journal Video about Identification of protein complexes with quantitative proteomics in S. cerevisiae at JoVE.com

Identification of protein complexes with quantitative proteomics in S. cerevisiae

Aquí se describe una nueva técnica de proteómica cuantitativa para la identificación de complejos de proteínas en Saccharomyces cerevisiae. En este estudio, hemos utilizado el método de SILAC junto con la purificación de afinidad seguida de espectrometría de masas para identificar con una alta especificidad de la unión de compañeros de una proteína del RE, Scs2p.

Identificación de los complejos de proteínas con la proteómica cuantitativa en S. cerevisiae

Lipids are the building blocks of cellular membranes that function as barriers and in compartmentalization of cellular processes, and recently, as ...

Research

JoVE Journal

Biology

Assay for Adhesion and Agar Invasion in S. cerevisiae

Ensayo de adhesión y la invasión de agar en S. cerevisiae

Yeasts are found in natural biofilms, where many microorganisms colonize surfaces. In artificial environments, such as surfaces of man-made objects, ...

Investigación

Biología

Proteomics to Identify Proteins Interacting with P2X2 Ligand-Gated Cation Channels

Proteómica para identificar proteínas que interactúan con los canales de cationes P2X2 ligando

Ligand-gated ion channels underlie synaptic communication in the nervous system1. In mammals there are three families of ligand-gated channels: the cys ...

A high-throughput method to globally study the organelle morphology in S. cerevisiae

Un método de alto rendimiento a nivel mundial para estudiar la morfología orgánulo en S. cerevisiae

High-throughput methods to examine protein localization or organelle morphology is an effective tool for studying protein interactions and can help ...

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

Phosphoproteomics cuantitativo de ácidos grasos estimulada Saccharomyces cerevisiae</em

This protocol describes the growth and stimulation, with the fatty acid oleate, of isotopically heavy and light S. cerevisiae cells. Cells are ground ...

Studying Age-dependent Genomic Instability using the S. cerevisiae Chronological Lifespan Model

Studying Age-dependent Genomic Instability using the S. cerevisiae Chronological Lifespan Model

El estudio de dependientes de la edad de Inestabilidad Genómica con el S. cerevisiae Cronológica Modelo Longevidad

Studies using the Saccharomyces cerevisiae aging model have uncovered life span regulatory pathways that are partially conserved in higher eukaryotes1-2. ...

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Identificación de los complejos de proteínas en<em&gt; Escherichia coli</em&gt; La purificación mediante afinidad del péptido secuencial en combinación con espectrometría de masas tándem

Since most cellular processes are mediated by macromolecular assemblies, the systematic identification of protein-protein interactions (PPI) and the ...

Flow Cytometry-based Purification of S. cerevisiae Zygotes

Flow Cytometry-based Purification of S. cerevisiae Zygotes

Citometría de flujo basado Purificación de<em&gt; S. cerevisiae</em&gt; Los cigotos

Zygotes are essential intermediates between haploid and diploid states in the life cycle of many organisms, including yeast (Figure 1) 1. S. cerevisiae ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

Visualización y Análisis de las moléculas de ARNm mediante fluorescencia<em&gt; In Situ</em&gt; La hibridación en<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

Los ensayos acoplados para Monitoreo replegamiento de proteínas en<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Proteostasis, defined as the combined processes of protein folding/biogenesis, refolding/repair, and degradation, is a delicate cellular balance that must ...

Identification of Post-translational Modifications of Plant Protein Complexes

Identificación de modificaciones post-traduccionales de la proteína vegetal Complejos

Plants adapt quickly to changing environments due to elaborate perception and signaling systems. During pathogen attack, plants rapidly respond to ...