Name: identification of protein complexes with quantitative proteomics in s. cerevisiae
Uploaded: 2009-03-04T00:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Identification of protein complexes with quantitative proteomics in S. cerevisiae at JoVE.com

Material och metoder <ol><li> Jäststammar <ul><li> Alla stammar som används i denna studie är baserade på BY4742 bakgrunden. Den SILAC kontroll stam (Matt en, his3, leu2, ura3, lys2 och Arg4:: G418) gjordes vid parning Arg4 radering stam (Matt en, his3, ura3, leu2 och Arg4:: G418) till BY4742 (Mat alfa, his3, leu2, ura3 och lys2) och meiotiska haploids erhölls genom tetrad dissekering. Därför är kontroll stam en auxotroph för lysin och arginin. Betet stammen gjordes av PCR-...

<ol>
	<li>Loewen, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inheritance+of+cortical+ER+in+yeast+is+required+for+normal+septin+organization.">Inheritance of cortical ER in yeast is required for normal septin organization.</a> Jour. Cell Biol. 179, 467-483 .</li><li>Ong, S., Foster, L. J., Hoog, C. L., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+spectrometric-based+approaches+in+quantitative+proteomics.">Mass spectrometric-based approaches in quantitative proteomics.</a> Methods. 29, 124-130 .</li><li>Puig, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Tandem+Affinity+Purification+(TAP)+method:+a+general+procedure+of+protein+complex+purification.">The Tandem Affinity Purification (TAP) method: a general procedure of protein complex purification.</a> Methods. 24, 218-229 .</li><li>Amberg, D. C., Burke, D. J., Strathern, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+in+Yeast+Genetics.">Methods in Yeast Genetics.</a> , 123-125 .</li></ol>

Den alikvoter sparat under reningen förfarande bör omfatta (1) före rensas cell lysat, (2) bundna fraktionen, (3) obundna fraktionen, och (4) eluerade bråk. Vi rekommenderar att analysera protein innehållet i ovanstående alikvoter av Western blotting med anti-TAP antikropp eller silverfärgning att återspegla den bindande och eluerande effektiviteten i experimentet. Exempel på en silver färgad gel och en blot visas i figur 1. Sedan SILAC ger oss objektiva och kvantifierade mätninga...

identification of protein complexes with quantitative proteomics in s. cerevisiae

Lipider är byggstenar i cellmembran som fungerar som barriärer och i uppdelning av cellulära processer, och nyligen, som viktiga intracellulära signalmolekyler. Men till skillnad från proteiner, lipider är små hydrofoba molekyler att trafiken i första hand av dåligt beskrivna nonvesicular rutter, som är en hypotes att ske på platser membran kontakt (MCSS). MCSS är regioner där endoplasmatiska retiklet (ER) gör direkt fysisk kontakt med en partnering organell, t.ex. plasmamembran (PM). ER del av ER-PM MCSS anrikas i lipid-syntetiserande enzymer, vilket tyder på att lipid syntes vänder sig till dessa platser och som innebär att MCSS är viktiga för lipid trafik. Jäst är en idealisk modell för att studera ER-PM MCSS på grund av sitt överflöd, med över 1000 kontakter per cell, och deras bevarade natur i alla eukaryoter. Upptäcka de proteiner som utgör MCSS är avgörande för att förstå hur lipider trafiken sker i cellerna och hur de fungerar som signalmolekyler. Vi har funnit att ett ER kallas Scs2p lokalisera till ER-PM MCSS och är viktig för deras bildande. Vi fokuserar på att avslöja molekylära partners Scs2p. Identifiering av proteinkomplex bygger traditionellt på första lösa renat protein prover med gelelektrofores, följt av i-gel nedbrytning av protein band och analys av peptider med masspektrometri. Detta begränsar ofta studien till en liten delmängd av proteiner. Dessutom är proteinkomplex utsätts för denaturering eller icke-fysiologiska förhållanden under förfarandet. För att kringgå dessa problem har vi genomfört en omfattande kvantitativ proteomik teknik för att utvinna objektiva och kvantifierade uppgifter. Vi använder oss av stabila isotopen märkning med aminosyror i cellkultur (SILAC) för att införliva häfta isotop kärnor i proteiner i en otaggad kontrollisolat. Lika volymer av taggade kultur och omärkta, SILAC-märkt kultur blandas och lyseras av slipning i flytande kväve. Vi genomför sedan en procedur affinitet rening för att dra ner protein komplex. Slutligen fällning vi proteinet provet, som är redo för analys med högpresterande vätskekromatografi / tandem masspektrometri. Viktigast är proteiner i kontrollrummet stam märkt av den tunga isotopen och kommer att producera en massa / laddning förskjutning som kan kvantifieras mot omärkta proteiner i betet stammen. Därför kan föroreningar eller ospecifika bindande lätt elimineras. Genom att använda denna metod har vi identifierat flera nya proteiner som lokaliserar till ER-PM MCSS. Här presenterar vi en detaljerad beskrivning av vårt synsätt.

Watch this Scientific Journal Video about Identification of protein complexes with quantitative proteomics in S. cerevisiae at JoVE.com

Identification of protein complexes with quantitative proteomics in S. cerevisiae

Här beskriver vi en ny kvantitativ proteomik teknik för att identifiera proteinkomplex i Saccharomyces cerevisiae. I denna studie har vi använt SILAC metoden tillsammans med affinitet rening följt av tandem masspektrometri för att identifiera sig med hög specificitet bindande partner en ER protein, Scs2p.

Kartläggning av protein komplex med kvantitativa proteomik i S. cerevisiae

Lipids are the building blocks of cellular membranes that function as barriers and in compartmentalization of cellular processes, and recently, as ...

Research

JoVE Journal

Biology

Assay for Adhesion and Agar Invasion in S. cerevisiae

Analys för vidhäftningsförmåga och agar Invasion i S. cerevisiae

Yeasts are found in natural biofilms, where many microorganisms colonize surfaces. In artificial environments, such as surfaces of man-made objects, ...

Proteomics to Identify Proteins Interacting with P2X2 Ligand-Gated Cation Channels

Proteomik för att identifiera proteiner Interagera med P2X2 ligandreglerade munikationsvägar

Ligand-gated ion channels underlie synaptic communication in the nervous system1. In mammals there are three families of ligand-gated channels: the cys ...

A high-throughput method to globally study the organelle morphology in S. cerevisiae

En hög genomströmning metod för att globalt studera organell morfologi i S. cerevisiae

High-throughput methods to examine protein localization or organelle morphology is an effective tool for studying protein interactions and can help ...

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

Kvantitativa Phosphoproteomics i Fatty Acid Stimulerade Saccharomyces cerevisiae</em

This protocol describes the growth and stimulation, with the fatty acid oleate, of isotopically heavy and light S. cerevisiae cells. Cells are ground ...

Studying Age-dependent Genomic Instability using the S. cerevisiae Chronological Lifespan Model

Studying Age-dependent Genomic Instability using the S. cerevisiae Chronological Lifespan Model

Studera age-dependent genomisk instabilitet med S. cerevisiae Kronologisk Livslängd Modell

Studies using the Saccharomyces cerevisiae aging model have uncovered life span regulatory pathways that are partially conserved in higher eukaryotes1-2. ...

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Identifiering av proteinkomplex i<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Hjälp Sekventiell rening peptid affinitet i kombination med tandem masspektrometri

Since most cellular processes are mediated by macromolecular assemblies, the systematic identification of protein-protein interactions (PPI) and the ...

Flow Cytometry-based Purification of S. cerevisiae Zygotes

Flow Cytometry-based Purification of S. cerevisiae Zygotes

Flödescytometri-baserad rening av<em&gt; S. cerevisiae</em&gt; Zygoter

Zygotes are essential intermediates between haploid and diploid states in the life cycle of many organisms, including yeast (Figure 1) 1. S. cerevisiae ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

Visualisering och analys av mRNA-molekyler användning av fluorescens<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisering i<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

Kopplade Analyser för övervakning Proteinåterveckningssteg i<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Proteostasis, defined as the combined processes of protein folding/biogenesis, refolding/repair, and degradation, is a delicate cellular balance that must ...

Identification of Post-translational Modifications of Plant Protein Complexes

Identifiering av posttranslationella modifieringar av växtproteinkomplex

Plants adapt quickly to changing environments due to elaborate perception and signaling systems. During pathogen attack, plants rapidly respond to ...