Name: identification of protein complexes with quantitative proteomics in s. cerevisiae
Uploaded: 2009-03-04T00:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Identification of protein complexes with quantitative proteomics in S. cerevisiae at JoVE.com

Gereç ve Yöntem <ol><li> Maya suşları <ul><li> Bu çalışmada kullanılan tüm suşlar BY4742 arka plan üzerine dayanır. Arg4 silme suşu (G418: Mat, his3, ura3, leu2 ve Arg4): BY4742 (Mat alfa, çiftleşme SILAC kontrol suşu (Mat, his3, leu2, ura3, lys2 ve Arg4: G418) tarafından yapıldı his3, leu2, ura3 ve lys2) ve mayotik haploids tetrad diseksiyonu ile elde edilmiştir. Bu nedenle, kontrol suşu, lisin ve arjinin bir auxotroph. Yem gerilme vektörü pBS1479 ku...

<ol>
	<li>Loewen, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inheritance+of+cortical+ER+in+yeast+is+required+for+normal+septin+organization.">Inheritance of cortical ER in yeast is required for normal septin organization.</a> Jour. Cell Biol. 179, 467-483 .</li><li>Ong, S., Foster, L. J., Hoog, C. L., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+spectrometric-based+approaches+in+quantitative+proteomics.">Mass spectrometric-based approaches in quantitative proteomics.</a> Methods. 29, 124-130 .</li><li>Puig, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Tandem+Affinity+Purification+(TAP)+method:+a+general+procedure+of+protein+complex+purification.">The Tandem Affinity Purification (TAP) method: a general procedure of protein complex purification.</a> Methods. 24, 218-229 .</li><li>Amberg, D. C., Burke, D. J., Strathern, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+in+Yeast+Genetics.">Methods in Yeast Genetics.</a> , 123-125 .</li></ol>

Arıtma işlemi sırasında kaydedilen alikotları (1) ön-temizlenir hücre lizat, (2) bağlı fraksiyon, (3) bağlanmamış fraksiyonu, ve (4) yıkandı, fraksiyon içermelidir. Biz Batı tarafından yukarıda alikotları protein içeriğini analiz deney bağlayıcı ve salınımlı etkinliğini yansıtmak için anti-TAP antikor veya gümüş boyama kullanarak blot önerilir. Gümüş lekeli bir jel ve leke örnekleri Şekil 1&#39;de gösterilmiştir. SILAC protein bağlayıcı ortakları,...

identification of protein complexes with quantitative proteomics in s. cerevisiae

Lipidler önemli hücre içi sinyal molekülleri olarak, son zamanlarda engel olarak ve hücre zarının bu işlev, hücresel süreçlerin compartmentalization içinde yapı taşları ve. Ancak, proteinlerin aksine, lipidler, küçük hidrofobik moleküllerdir öncelikle membran iletişim siteleri (MCSS) meydana varsayımla kötü açıklanan nonvesicular yolları, trafik. MCSS endoplazmik retikulum (ER) bir ortaklık organel, örneğin, plazma zarı (PM) ile doğrudan fiziksel temas yapan bölgelerdir. Bu lipid sentezini bu sitelere ve MCSS lipid trafiği için önemli olduğunu ima, lipid sentezleme enzimleri, ER-PM MCSS ER bölümü zenginleştirilmiştir. Maya 1000&#39;den fazla hücre başına kişiler ve tüm ökaryotlarda korunmuş doğa, bolluk nedeniyle ER-PM MCSS çalışma için ideal bir model. MCSS oluşturan proteinler ortaya çıkararak hücrelerindeki lipidler trafik nasıl yapılır anlamak için önemlidir, ve sinyal molekülleri olarak hareket. Biz Scs2p denilen bir ER ER-PM MCSS lokalize bulundu ve kendi oluşumu için önemlidir. Biz Scs2p moleküler ortaklarının ortaya çıkarılması üzerinde duruldu. Protein kompleksleri tanımlanması geleneksel olarak ilk kez kütle spektrometresi tarafından peptidlerin protein bantları ve analiz jel sindirim jel elektroforez, saflaştırılmış protein örnekleri çözme dayanır. Bu genellikle proteinlerin küçük bir alt çalışma sınırlar. Ayrıca, protein kompleksleri işlem sırasında denatüre veya fizyolojik olmayan koşullara maruz kalmaktadır. Bu sorunları aşmak için, tarafsız ve nicel veri ayıklamak için büyük ölçekli nicel proteomik tekniği uyguladık. Biz, bir etiketsiz kontrol suşu proteinlerin zımba izotop çekirdekleri dahil hücre kültürü amino asitleri (SILAC) ile stabil izotop etiketleme kullanın. Eşit hacimli, etiketli, kültür ve etiketsiz, SILAC etiketli kültürü birbirine karıştırılır ve sıvı nitrojen içinde taşlama tarafından parçalanmış. Daha sonra protein kompleksleri aşağı çekmek için bir yakınlık arıtma işlemi yürütmek. Sonuç olarak, yüksek performanslı sıvı kromatografisi / tandem kütle spektrometresi ile analiz için hazır protein örnek, hızlandırabilir. En önemlisi, kontrol suşu proteinler ağır izotop etiketli ve etiketsiz proteinlere karşı yem zorlanma sayılabilir edilebilir bir kütle / yük değişimi üretecek. Bu nedenle, kirleticiler, ya da belirsiz bağlama kolayca ortadan kaldırılabilir. Bu yaklaşımı kullanarak, ER-PM MCSS lokalize birkaç roman proteinleri tespit ettik. Burada bizim yaklaşımımız ayrıntılı bir açıklama mevcut.

Watch this Scientific Journal Video about Identification of protein complexes with quantitative proteomics in S. cerevisiae at JoVE.com

Identification of protein complexes with quantitative proteomics in S. cerevisiae

Burada Saccharomyces cerevisiae protein kompleksleri tanımlamak için yeni bir nicel proteomik tekniği açıklar. Bu çalışmada, yüksek özgüllük ile bir ER protein, Scs2p bağlayıcı ortakları tanımlamak için tandem kütle spektrometresi tarafından takip yakınlık arıtma ile birlikte SILAC yöntemi kullandık.

S. cerevisiae, kantitatif proteomik protein kompleksleri tanımlanması

Lipids are the building blocks of cellular membranes that function as barriers and in compartmentalization of cellular processes, and recently, as ...

Research

JoVE Journal

Biology

Assay for Adhesion and Agar Invasion in S. cerevisiae

S. cerevisiae yapışma ve Agar Invasion için Testi

Yeasts are found in natural biofilms, where many microorganisms colonize surfaces. In artificial environments, such as surfaces of man-made objects, ...

Proteomics to Identify Proteins Interacting with P2X2 Ligand-Gated Cation Channels

P2X2 Ligandla Gated Katyon Kanalları ile etkileşimde Proteinler tanımlamak için Proteomik

Ligand-gated ion channels underlie synaptic communication in the nervous system1. In mammals there are three families of ligand-gated channels: the cys ...

A high-throughput method to globally study the organelle morphology in S. cerevisiae

S. cerevisiae &quot;adlı organel morfolojisi küresel çalışma yüksek verimli bir yöntem

High-throughput methods to examine protein localization or organelle morphology is an effective tool for studying protein interactions and can help ...

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

Yağ Asidi Kantitatif Phosphoproteomics Uyarılmış Saccharomyces cerevisiae</em

This protocol describes the growth and stimulation, with the fatty acid oleate, of isotopically heavy and light S. cerevisiae cells. Cells are ground ...

Studying Age-dependent Genomic Instability using the S. cerevisiae Chronological Lifespan Model

Studying Age-dependent Genomic Instability using the S. cerevisiae Chronological Lifespan Model

Yaşa bağımlı Genomik İstikrarsızlık incelenmesi S. cerevisiae Kronolojik ömrü Modeli

Studies using the Saccharomyces cerevisiae aging model have uncovered life span regulatory pathways that are partially conserved in higher eukaryotes1-2. ...

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Protein Kompleksi belirlenmesi<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Tandem Kütle Spektrometresi ile Kombine Sıralı Peptid Affinity Arıtma kullanarak

Since most cellular processes are mediated by macromolecular assemblies, the systematic identification of protein-protein interactions (PPI) and the ...

Flow Cytometry-based Purification of S. cerevisiae Zygotes

Flow Cytometry-based Purification of S. cerevisiae Zygotes

Akış Sitometri tabanlı Arıtma<em&gt; S. cerevisiae</em&gt; Zigot

Zygotes are essential intermediates between haploid and diploid states in the life cycle of many organisms, including yeast (Figure 1) 1. S. cerevisiae ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

Floresan kullanarak mRNA Moleküllerin Görselleştirme ve Analiz<em&gt; Yerinde</emIn&gt; Hibridizasyon<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

İzlenmesi protein refolding için birleştiğinde Tahliller<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Proteostasis, defined as the combined processes of protein folding/biogenesis, refolding/repair, and degradation, is a delicate cellular balance that must ...

Identification of Post-translational Modifications of Plant Protein Complexes

Plant protein kompleksleri, çevirim sonrası değişikliklerin belirlenmesi

Plants adapt quickly to changing environments due to elaborate perception and signaling systems. During pathogen attack, plants rapidly respond to ...