Name: zebrafish whole mount high-resolution double fluorescent in situ hybridization
Uploaded: 2009-03-25T00:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Zebrafish Whole Mount High-Resolution Double Fluorescent In Situ Hybridization at JoVE.com

We willen graag de bijdragen van Dörthe Jülich, Jennifer Ronde en Andrew Mara erkennen in de ontwikkeling van dit protocol. Ondersteuning van het onderzoek door de NICHD, de American Cancer Society en de March of Dimes.

1. FIXATION <ol><li> Fix embryo&#39;s overnacht bij 4 ° C met 4% paraformaldehyde (PFA) in PBS. </li><li> Verwijder de fix en was 2 x PBS, 5 minuten bij kamertemperatuur (RT). </li><li> Handmatig dechorionate embryo&#39;s in PBS in een glazen plaat met behulp van depressie horlogemaker tang. Na dechorionation, worden embryo&#39;s met behulp van een brand-gepolijst glas Pasteur pipet omdat ze kunnen blijven plakken aan polypropyleen pipetten. </li><li> Overdracht van embryo&#39;s door middel van een serie van 25%, 50%...

<ol>
	<li>Schulte-Merker, S., Ho, R. K., Herrmann, B. G., N&#252;sslein-Volhard, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+protein+product+of+the+zebrafish+homologue+of+the+mouse+T-gene+is+expressed+in+nuclie+of+the+germ+ring+and+the+notochord+of+the+early+embryo.">The protein product of the zebrafish homologue of the mouse T-gene is expressed in nuclie of the germ ring and the notochord of the early embryo.</a> Development. 116, 1021-1027 (1992).</li><li>Jowett, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Double+in+situ+hybridization+techniques+in+zebrafish.">Double in situ hybridization techniques in zebrafish.</a> Methods. 23, 345-358 (2001).</li><li>J&#252;lich, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=beamter/deltaC+and+the+role+of+Notch+ligands+in+the+zebrafish+somite+segmentation,+hindbrain+neurogenesis+and+hypochord+differentiation.">beamter/deltaC and the role of Notch ligands in the zebrafish somite segmentation, hindbrain neurogenesis and hypochord differentiation.</a> Dev Biol. 286, 391-404 (2005).</li><li>Mara, A., Schroeder, J., Chalouni, C., Holley, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Priming,+Initiation+and+Synchronization+of+the+Segmentation+Clock+by+deltaD+and+deltaC.">Priming, Initiation and Synchronization of the Segmentation Clock by deltaD and deltaC.</a> Nat Cell Biol. 9, 523-530 (2007).</li><li>Lecuyer, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+analysis+of+mRNA+localization+reveals+a+prominent+role+in+organizing+cellular+architecture+and+function.">Global analysis of mRNA localization reveals a prominent role in organizing cellular architecture and function.</a> Cell. 131, 174-187 (2007).</li></ol>

Het protocol hier gepresenteerde werkt goed met probes die een schone sterk signaal te geven na kleuring voor 30-45 minuten in een typisch alkalische fosfatase-gemedieerde reactie. Voorafgaand aan het uitvoeren van de fluorescente in situ hybridisatie protocol, we altijd testen onze sondes met behulp van de standaard niet-fluorescerende protocol (voorzien in aanvullende materiaal, samen met de sonde synthese-protocol). We hebben minder succes met de fluorescente in situ hybridisatie protocol bij het gebruik van zwakkere...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Paraformaldehyde 16% solution, EM Grade</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Electron Microscopy Services</td>
<td>15710</td>
<td>Dilute to 4% in 1.33x PBS (final 1x). Store in 2ml aliquots at &#x2013;20&deg;C</td>
</tr>
<tr>
<td>Proteinase K, recombinant PCR grade</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roche</td>
<td>03115879001</td>
<td>Make a 20mg/ml stock solution in water. Store in 1ml aliquots at &#x2013;20&deg;C</td>
</tr>
<tr>
<td>Blocking Reagent</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roche</td>
<td>11096176001</td>
<td>Make a 10% stock solution in 1x maleic acid buffer. Store in 50ml aliquots at &#x2013;20&deg;C. Stable over multiple freeze/thaws.</td>
</tr>
<tr>
<td>Anti-Fluorescein-POD, Fab fragments</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roche</td>
<td>11426346910</td>
<td>Aliquot and store at -20&deg;C. Keep one working aliquot at 4&deg;C.</td>
</tr>
<tr>
<td>Anti-Digoxigenin-POD, Fab fragments</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roche</td>
<td>11207739910</td>
<td>As above.</td>
</tr>
<tr>
<td>TSA Plus Fluorescein system</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Perkin Elmer</td>
<td>NEL741001KT</td>
<td>Prepare each vial of TSA reagent only when needed. Dissolve in 60&mu;l DMSO. Store at 4&deg;C.</td>
</tr>
<tr>
<td>TSA Plus Cyanine5 system</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Perkin Elmer</td>
<td>NEL745001KT</td>
<td>As above</td>
</tr>
<tr>
<td>TSA Plus Cyanine3 system</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Perkin Elmer</td>
<td>NEL744001KT</td>
<td>As above</td>
</tr>
<tr>
<td>TSA Kit #16 AlexaFluor647 tyramide (plus HRP-goat-anti-rabbit IgG)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Molecular Probes /Invitrogen</td>
<td>T20926</td>
<td>Dissolve tyramide reagent in 150&mu;l DMSO, aliquot and store at &#x2013;20&deg;C.</td>
</tr>
<tr>
<td>RNase, DNase free</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roche</td>
<td>11119915001</td>
<td>Supplied as 500&mu;g/ml solution</td>
</tr>
<tr>
<td>Propidium Iodide</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Molecular Probes /Invitrogen</td>
<td>P-3566</td>
<td>Supplied as 1mg/ml solution in water.</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

zebrafish whole mount high-resolution double fluorescent in situ hybridization

Whole mount<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisatie is een van de meest gebruikte technieken in de ontwikkelingsbiologie. Hier presenteren wij een hoge resolutie dubbele tl<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisatie protocol voor de analyse van de precieze expressiepatroon van een enkel gen en voor het bepalen van de overlap van de expressie-domeinen van twee genen. Het protocol is een aangepaste versie van de standaard<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisatie met behulp van alkalische fosfatase en substraten zoals NBT / BCIP en snelle Red<sup&gt; 1,2</sup&gt;. Dit protocol maakt gebruik van standaard digoxygenin en fluoresceïne gelabelde probes, samen met tyramide signaalversterking (TSA)<sup&gt; 3</sup&gt;. De commercieel verkrijgbare TSA kits maken een flexibele opzet van het experiment fluorescentie-emissie van groen naar ver-rood kan worden gebruikt in combinatie met diverse nucleaire vlekken, zoals propidiumjodide, of fluorescentie immunohistochemie voor eiwitten. TSA produceert een reactieve fluorescent substraat die snel covalent bindt aan groepen, meestal tyrosine residuen, in de directe omgeving van de gelabelde antisense riboprobe. De resulterende kleurpatronen zijn hoge resolutie in die subcellulaire lokalisatie van het mRNA kan worden waargenomen met behulp van laser scanning confocale microscopie<sup&gt; 3,4</sup&gt;. Men kan waarnemen ontluikende transcripten in de chromosomale loci, onderscheiden nucleaire en cytoplasmatische kleuring en visualiseren andere patronen, zoals corticale lokalisatie van mRNA. Studies in<em&gt; Drosophila</em&gt; Geven aan dat ongeveer 70% van de mRNA&#39;s specifieke patronen van de subcellulaire lokalisatie die vaak samenhangen met de functie van het gecodeerde eiwit vertonen<sup&gt; 5</sup&gt;. In combinatie met computer-aided reconstructie van 3D-confocale datasets, ons protocol maakt een gedetailleerde analyse van mRNA distributie met sub-cellulaire resolutie in zijn geheel gewervelde embryo&#39;s.

Watch this Scientific Journal Video about Zebrafish Whole Mount High-Resolution Double Fluorescent In Situ Hybridization at JoVE.com

Zebrafish Whole Mount High-Resolution Double Fluorescent In Situ Hybridization

Hele monteren in situ hybridisatie is een van de meest gebruikte technieken in de ontwikkelingsbiologie. Hier presenteren wij een hoge resolutie dubbele fluorescente in situ hybridisatie protocol voor de analyse van de precieze expressiepatroon van een enkel gen en voor het bepalen van de overlap van de expressie-domeinen van twee genen. We nemen een propidiumjodide nucleair anti-vlek weefsel organisatie te markeren.

Zebravis hele Mount High-Resolution Double Fluorescent In Situ Hybridisatie

Whole mount in situ hybridization is one of the most widely used techniques in developmental biology.  Here, we present a high-resolution double ...

Research

JoVE Journal

Biology

Zebrafish Whole Mount High-Resolution Double Fluorescent In Situ Hybridization

Double Whole Mount in situ Hybridization of Early Chick Embryos

Dubbele Hele Mount in situ hybridisatie van het vroege embryo&#39;s Chick

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

Method for Whole Mount Antibody Staining in Chick

Methode voor Whole Mount antilichaam kleuring in Chick

Using Whole Mount in situ Hybridization to Link Molecular and Organismal Biology

Using Whole Mount in situ Hybridization to Link Molecular and Organismal Biology

Met behulp van Whole Mount In situ Hybridisatie aan Moleculaire Biologie en organismale Link

Whole mount in situ hybridization (WISH) is a common technique in molecular biology laboratories used to study gene expression through the localization of ...

Polarized Translocation of Fluorescent Proteins in Xenopus Ectoderm in Response to Wnt Signaling

Polarized Translocation of Fluorescent Proteins in Xenopus Ectoderm in Response to Wnt Signaling

Gepolariseerde Translocatie van fluorescerende eiwitten in Xenopus Ectoderm in reactie op Wnt signalering

Cell polarity is a fundamental property of eukaryotic cells that is dynamically regulated by both intrinsic and extrinsic factors during embryonic ...

Whole Mount in Situ Hybridization of E8.5 to E11.5 Mouse Embryos

Whole Mount in Situ Hybridization of E8.5 to E11.5 Mouse Embryos

Hele Mount<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisatie van E8.5 aan E11.5 muis embryo&#39;s

Whole mount in situ hybridization is a very informative approach for defining gene expression patterns in embryos. The in situ hybridization procedures ...

Analysis of Single-cell Gene Transcription by RNA Fluorescent In Situ Hybridization (FISH)

Analysis of Single-cell Gene Transcription by RNA Fluorescent In Situ Hybridization FISH

Analyse van de Single-cell gentranscriptie door RNA TL<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisatie (FISH)

Adhesion of Plasmodium falciparum infected erythrocytes (IE) to human endothelial receptors during malaria infections is mediated by expression of PfEMP1 ...

Chromosome Replicating Timing Combined with Fluorescent In situ Hybridization

Chromosome Replicating Timing Combined with Fluorescent In situ Hybridization

Chromosoom repliceren Timing In combinatie met TL-<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisatie

Mammalian DNA replication initiates at multiple sites along chromosomes at different times during S phase, following a temporal replication program. The ...

Whole Mount RNA Fluorescent in situ Hybridization of Drosophila Embryos

Whole Mount RNA Fluorescent in situ Hybridization of Drosophila Embryos

Hele Mount RNA TL<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisatie van<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryo&#39;s

Assessing  the expression pattern of a gene, as well as the subcellular localization  properties of its transcribed RNA, are key features for ...

RNA In situ Hybridization in Whole Mount Embryos and Cell Histology Adapted for Marine Elasmobranchs

RNA In situ Hybridization in Whole Mount Embryos and Cell Histology Adapted for Marine Elasmobranchs

RNA<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisatie in Hele Mount Embryo&#39;s en histologie Aangepast voor Marine kraakbeenvissen

Marine  elasmobranchs are valued animal models for biomedical and genomic studies as  they are the most primitive vertebrates to have adaptive immunity ...

High Resolution Whole Mount In Situ Hybridization within Zebrafish Embryos to Study Gene Expression and Function

High Resolution Whole Mount In Situ Hybridization within Zebrafish Embryos to Study Gene Expression and Function

Hoge resolutie Hele Mount<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisatie in zebravis embryo&#39;s om genexpressie en functie te bestuderen

This article focuses on whole-mount in situ hybridization (WISH) of zebrafish embryos. The WISH technology facilitates the assessment of gene expression ...