Name: zebrafish whole mount high-resolution double fluorescent in situ hybridization
Uploaded: 2009-03-25T00:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Zebrafish Whole Mount High-Resolution Double Fluorescent In Situ Hybridization at JoVE.com

Vorremmo ringraziare per i contributi di Dörthe Jülich, Jennifer e Andrew rotonda Mara nello sviluppo di questo protocollo. Sostenere la ricerca fornita dal NICHD, l&#39;American Cancer Society e la March of Dimes.

1. FISSAGGIO <ol><li> Fissare gli embrioni notte a 4 ° C con il 4% paraformaldeide (PFA) in PBS. </li><li> Rimuovere e lavare fissare 2 x PBS, 5 minuti ciascuno a temperatura ambiente (RT). </li><li> Embrioni manualmente dechorionate in PBS in un piatto depressione vetro con pinze orologiaio. Dopo dechorionation, gli embrioni vengono trasferiti utilizzando un incendio lucidato vetro pipetta Pasteur in quanto possono attenersi a pipette polipropilene. </li><li> Trasferimento di embrioni attraverso una serie di 25%, 50...

<ol>
	<li>Schulte-Merker, S., Ho, R. K., Herrmann, B. G., N&#252;sslein-Volhard, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+protein+product+of+the+zebrafish+homologue+of+the+mouse+T-gene+is+expressed+in+nuclie+of+the+germ+ring+and+the+notochord+of+the+early+embryo.">The protein product of the zebrafish homologue of the mouse T-gene is expressed in nuclie of the germ ring and the notochord of the early embryo.</a> Development. 116, 1021-1027 (1992).</li><li>Jowett, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Double+in+situ+hybridization+techniques+in+zebrafish.">Double in situ hybridization techniques in zebrafish.</a> Methods. 23, 345-358 (2001).</li><li>J&#252;lich, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=beamter/deltaC+and+the+role+of+Notch+ligands+in+the+zebrafish+somite+segmentation,+hindbrain+neurogenesis+and+hypochord+differentiation.">beamter/deltaC and the role of Notch ligands in the zebrafish somite segmentation, hindbrain neurogenesis and hypochord differentiation.</a> Dev Biol. 286, 391-404 (2005).</li><li>Mara, A., Schroeder, J., Chalouni, C., Holley, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Priming,+Initiation+and+Synchronization+of+the+Segmentation+Clock+by+deltaD+and+deltaC.">Priming, Initiation and Synchronization of the Segmentation Clock by deltaD and deltaC.</a> Nat Cell Biol. 9, 523-530 (2007).</li><li>Lecuyer, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+analysis+of+mRNA+localization+reveals+a+prominent+role+in+organizing+cellular+architecture+and+function.">Global analysis of mRNA localization reveals a prominent role in organizing cellular architecture and function.</a> Cell. 131, 174-187 (2007).</li></ol>

Il protocollo presentato qui funziona bene con le sonde che danno un forte segnale pulito dopo la colorazione per 30-45 minuti in una fosfatasi alcalina-mediata tipica reazione. Prima di eseguire il protocollo di ibridazione fluorescente in situ, abbiamo sempre testare le nostre sonde utilizzando lo standard non fluorescente protocollo (fornito in materiale supplementare con il protocollo di sintesi sonda). Abbiamo avuto meno successo con il protocollo di ibridazione fluorescente in situ utilizzando sonde più debole, m...

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Paraformaldehyde 16% solution, EM Grade</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Electron Microscopy Services</td>
<td>15710</td>
<td>Dilute to 4% in 1.33x PBS (final 1x). Store in 2ml aliquots at &#x2013;20&deg;C</td>
</tr>
<tr>
<td>Proteinase K, recombinant PCR grade</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roche</td>
<td>03115879001</td>
<td>Make a 20mg/ml stock solution in water. Store in 1ml aliquots at &#x2013;20&deg;C</td>
</tr>
<tr>
<td>Blocking Reagent</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roche</td>
<td>11096176001</td>
<td>Make a 10% stock solution in 1x maleic acid buffer. Store in 50ml aliquots at &#x2013;20&deg;C. Stable over multiple freeze/thaws.</td>
</tr>
<tr>
<td>Anti-Fluorescein-POD, Fab fragments</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roche</td>
<td>11426346910</td>
<td>Aliquot and store at -20&deg;C. Keep one working aliquot at 4&deg;C.</td>
</tr>
<tr>
<td>Anti-Digoxigenin-POD, Fab fragments</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roche</td>
<td>11207739910</td>
<td>As above.</td>
</tr>
<tr>
<td>TSA Plus Fluorescein system</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Perkin Elmer</td>
<td>NEL741001KT</td>
<td>Prepare each vial of TSA reagent only when needed. Dissolve in 60&mu;l DMSO. Store at 4&deg;C.</td>
</tr>
<tr>
<td>TSA Plus Cyanine5 system</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Perkin Elmer</td>
<td>NEL745001KT</td>
<td>As above</td>
</tr>
<tr>
<td>TSA Plus Cyanine3 system</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Perkin Elmer</td>
<td>NEL744001KT</td>
<td>As above</td>
</tr>
<tr>
<td>TSA Kit #16 AlexaFluor647 tyramide (plus HRP-goat-anti-rabbit IgG)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Molecular Probes /Invitrogen</td>
<td>T20926</td>
<td>Dissolve tyramide reagent in 150&mu;l DMSO, aliquot and store at &#x2013;20&deg;C.</td>
</tr>
<tr>
<td>RNase, DNase free</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roche</td>
<td>11119915001</td>
<td>Supplied as 500&mu;g/ml solution</td>
</tr>
<tr>
<td>Propidium Iodide</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Molecular Probes /Invitrogen</td>
<td>P-3566</td>
<td>Supplied as 1mg/ml solution in water.</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

zebrafish whole mount high-resolution double fluorescent in situ hybridization

Intero monte<em&gt; In situ</emIbridazione&gt; è una delle tecniche più utilizzate in biologia dello sviluppo. Qui, presentiamo una ad alta risoluzione doppio fluorescente<em&gt; In situ</em&gt; Protocollo di ibridazione per analizzare il modello preciso espressione di un singolo gene e per determinare la sovrapposizione dei domini di espressione di due geni. Il protocollo è una versione modificata dello standard<em&gt; In situ</em&gt; Ibridazione con fosfatasi alcalina e substrati come NBT / BCIP e Fast Red<sup&gt; 1,2</sup&gt;. Questo protocollo utilizza standard di sonde digossigenina e marcato con fluoresceina amplificazione del segnale tyramide (TSA)<sup&gt; 3</sup&gt;. I kit disponibili in commercio permettono TSA flessibili di progettazione sperimentale emissione di fluorescenza da verde a rosso-lontano può essere utilizzato in combinazione con diverse macchie di nucleare, come lo ioduro di propidio, o immunoistochimica fluorescenza per le proteine. TSA produce un substrato reattivo fluorescente che rapidamente si lega covalentemente alla combinazione di sostanze, residui di tirosina di solito, nelle immediate vicinanze del riboprobe antisenso etichettati. Il risultante pattern di colorazione sono ad alta risoluzione in quella localizzazione subcellulare del mRNA può essere osservato con microscopio confocale a scansione laser<sup&gt; 3,4</sup&gt;. Si può osservare trascrizioni nascente presso i loci cromosomici, distinguere colorazione nucleare e citoplasmatica e visualizzare altri modelli come ad esempio la localizzazione corticale di mRNA. Studi in<em&gt; Drosophila</em&gt; Indicano che circa il 70% di mRNA presentano modelli specifici di localizzazione subcellulare che spesso in correlazione con la funzione della proteina codificata<sup&gt; 5</sup&gt;. Quando combinato con il computer-aided ricostruzione di set di dati 3D confocale, il nostro protocollo permette l&#39;analisi dettagliata della distribuzione mRNA con risoluzione sub-cellulare negli embrioni dei vertebrati tutto.

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Zebrafish Whole Mount High-Resolution Double Fluorescent In Situ Hybridization

Montare tutto ibridazione in situ è ​​una delle tecniche più utilizzate in biologia dello sviluppo. Qui, presentiamo una ad alta risoluzione doppio fluorescente in protocollo ibridazione in situ per analizzare il modello preciso espressione di un singolo gene e per determinare la sovrapposizione dei domini di espressione di due geni. Includiamo un propidio ioduro nucleare contro-macchia per evidenziare l&#39;organizzazione dei tessuti.

Zebrafish intero monte ad alta risoluzione doppia fluorescente In Situ Ibridazione

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