Name: zebrafish whole mount high-resolution double fluorescent in situ hybridization
Uploaded: 2009-03-25T00:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Zebrafish Whole Mount High-Resolution Double Fluorescent In Situ Hybridization at JoVE.com

Gostaríamos de agradecer as contribuições de Dorthe Jülich, Round Jennifer e Mara Andrew no desenvolvimento deste protocolo. Apoio à pesquisa fornecido pelo NICHD, a Sociedade Americana do Câncer ea March of Dimes.

1. FIXAÇÃO <ol><li> Fixar os embriões durante a noite a 4 ° C com paraformaldeído a 4% (PFA) em PBS. </li><li> Remover corrigir e lave 2 x PBS, 5 minutos cada em temperatura ambiente (RT). </li><li> Embriões manualmente dechorionate na PBS em uma placa de vidro com a pinça depressão relojoeiro. Depois dechorionation, os embriões são transferidos usando um fogo-de vidro polido pipeta Pasteur, pois podem ficar com pipetas de polipropileno. </li><li> Transferência de embriões através de uma série de 25%, 50...

<ol>
	<li>Schulte-Merker, S., Ho, R. K., Herrmann, B. G., N&#252;sslein-Volhard, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+protein+product+of+the+zebrafish+homologue+of+the+mouse+T-gene+is+expressed+in+nuclie+of+the+germ+ring+and+the+notochord+of+the+early+embryo.">The protein product of the zebrafish homologue of the mouse T-gene is expressed in nuclie of the germ ring and the notochord of the early embryo.</a> Development. 116, 1021-1027 (1992).</li><li>Jowett, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Double+in+situ+hybridization+techniques+in+zebrafish.">Double in situ hybridization techniques in zebrafish.</a> Methods. 23, 345-358 (2001).</li><li>J&#252;lich, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=beamter/deltaC+and+the+role+of+Notch+ligands+in+the+zebrafish+somite+segmentation,+hindbrain+neurogenesis+and+hypochord+differentiation.">beamter/deltaC and the role of Notch ligands in the zebrafish somite segmentation, hindbrain neurogenesis and hypochord differentiation.</a> Dev Biol. 286, 391-404 (2005).</li><li>Mara, A., Schroeder, J., Chalouni, C., Holley, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Priming,+Initiation+and+Synchronization+of+the+Segmentation+Clock+by+deltaD+and+deltaC.">Priming, Initiation and Synchronization of the Segmentation Clock by deltaD and deltaC.</a> Nat Cell Biol. 9, 523-530 (2007).</li><li>Lecuyer, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+analysis+of+mRNA+localization+reveals+a+prominent+role+in+organizing+cellular+architecture+and+function.">Global analysis of mRNA localization reveals a prominent role in organizing cellular architecture and function.</a> Cell. 131, 174-187 (2007).</li></ol>

O protocolo apresentado aqui funciona bem com sondas que dar um sinal forte limpa após coloração por 30-45 minutos em uma fosfatase alcalina mediada típico de reação. Antes de realizar a fluorescente no protocolo de hibridização in situ, sempre testamos nossas sondas utilizando o protocolo não fluorescente padrão (desde que no material suplementar juntamente com o protocolo de síntese de sonda). Temos tido menos sucesso com as fluorescentes em protocolo de hibridização in situ utilizando sondas quando mais ...

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<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Paraformaldehyde 16% solution, EM Grade</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Electron Microscopy Services</td>
<td>15710</td>
<td>Dilute to 4% in 1.33x PBS (final 1x). Store in 2ml aliquots at &#x2013;20&deg;C</td>
</tr>
<tr>
<td>Proteinase K, recombinant PCR grade</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roche</td>
<td>03115879001</td>
<td>Make a 20mg/ml stock solution in water. Store in 1ml aliquots at &#x2013;20&deg;C</td>
</tr>
<tr>
<td>Blocking Reagent</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roche</td>
<td>11096176001</td>
<td>Make a 10% stock solution in 1x maleic acid buffer. Store in 50ml aliquots at &#x2013;20&deg;C. Stable over multiple freeze/thaws.</td>
</tr>
<tr>
<td>Anti-Fluorescein-POD, Fab fragments</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roche</td>
<td>11426346910</td>
<td>Aliquot and store at -20&deg;C. Keep one working aliquot at 4&deg;C.</td>
</tr>
<tr>
<td>Anti-Digoxigenin-POD, Fab fragments</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roche</td>
<td>11207739910</td>
<td>As above.</td>
</tr>
<tr>
<td>TSA Plus Fluorescein system</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Perkin Elmer</td>
<td>NEL741001KT</td>
<td>Prepare each vial of TSA reagent only when needed. Dissolve in 60&mu;l DMSO. Store at 4&deg;C.</td>
</tr>
<tr>
<td>TSA Plus Cyanine5 system</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Perkin Elmer</td>
<td>NEL745001KT</td>
<td>As above</td>
</tr>
<tr>
<td>TSA Plus Cyanine3 system</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Perkin Elmer</td>
<td>NEL744001KT</td>
<td>As above</td>
</tr>
<tr>
<td>TSA Kit #16 AlexaFluor647 tyramide (plus HRP-goat-anti-rabbit IgG)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Molecular Probes /Invitrogen</td>
<td>T20926</td>
<td>Dissolve tyramide reagent in 150&mu;l DMSO, aliquot and store at &#x2013;20&deg;C.</td>
</tr>
<tr>
<td>RNase, DNase free</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roche</td>
<td>11119915001</td>
<td>Supplied as 500&mu;g/ml solution</td>
</tr>
<tr>
<td>Propidium Iodide</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Molecular Probes /Invitrogen</td>
<td>P-3566</td>
<td>Supplied as 1mg/ml solution in water.</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

zebrafish whole mount high-resolution double fluorescent in situ hybridization

Montar toda<em&gt; In situ</emHibridização&gt; é uma das técnicas mais utilizadas em biologia do desenvolvimento. Aqui, apresentamos uma alta resolução de dupla fluorescentes<em&gt; In situ</em&gt; Protocolo de hibridização para analisar o padrão de expressão precisa de um único gene e para determinar a sobreposição dos domínios de expressão dos dois genes. O protocolo é uma versão modificada do padrão<em&gt; In situ</em&gt; Hibridização com fosfatase alcalina e substratos tais como NBT / BCIP e Red Rápido<sup&gt; 1,2</sup&gt;. Este protocolo utiliza sondas padrão digoxigenina e fluoresceína rotulados junto com amplificação de sinal tiramida (TSA)<sup&gt; 3</sup&gt;. Os kits disponíveis comercialmente TSA permitem delineamento experimental flexível como emissão de fluorescência do verde ao vermelho-extremo pode ser usado em combinação com várias manchas nuclear, como o iodeto de propídio, ou imunohistoquímica de fluorescência para as proteínas. TSA produz um substrato reativo fluorescente que rapidamente covalentemente liga-se a metades, tipicamente resíduos de tirosina, nas imediações do riboprobe antisense rotulados. Os padrões de coloração resultantes são de alta resolução em que a localização subcelular do mRNA pode ser observado através de varredura a laser microscopia confocal<sup&gt; 3,4</sup&gt;. Pode-se observar transcrições nascente no loci cromossômicos, distinguir coloração nuclear e citoplasmática e visualizar outros padrões, como localização cortical de mRNA. Estudos em<em&gt; Drosophila</em&gt; Indicam que aproximadamente 70% dos mRNAs exibem padrões específicos de localização subcelular que freqüentemente se correlacionam com a função da proteína codificada<sup&gt; 5</sup&gt;. Quando combinado com computer-aided reconstrução de conjuntos de dados 3D confocal, o nosso protocolo permite a análise detalhada da distribuição de mRNA com sub-celular resolução em embriões vertebrados todo.

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Zebrafish Whole Mount High-Resolution Double Fluorescent In Situ Hybridization

Montar toda a hibridização in situ é uma das técnicas mais utilizadas em biologia do desenvolvimento. Aqui, apresentamos uma alta resolução de dupla fluorescentes em protocolo de hibridização in situ para analisar o padrão de expressão precisa de um único gene e para determinar a sobreposição dos domínios de expressão dos dois genes. Incluímos uma propidium iodeto nuclear contra-coloração para destacar a organização do tecido.

Zebrafish Whole Mount Alta Resolução Duplo Fluorescente In Situ Hibridização

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