Name: zebrafish whole mount high-resolution double fluorescent in situ hybridization
Uploaded: 2009-03-25T00:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Zebrafish Whole Mount High-Resolution Double Fluorescent In Situ Hybridization at JoVE.com

Nos gustaría agradecer las contribuciones de Dörthe Jülich, Ronda de Jennifer y Andrew Mara en el desarrollo de este protocolo. Apoyo a la investigación proporcionada por el NICHD, la Sociedad Americana del Cáncer y la Fundación March of Dimes.

1. FIJACIÓN <ol><li> Fix embriones noche a 4 ° C con 4% paraformaldehído (PFA) en PBS. </li><li> Quitar arreglar y lavar 2 x PBS, 5 minutos cada uno, a temperatura ambiente (RT). </li><li> Embriones manualmente dechorionate en PBS en una placa de vidrio depresión usando pinzas de relojero. Después de dechorionation, los embriones se transfieren por medio de un pulido al fuego pipeta Pasteur de vidrio, ya que puede adherirse a las pipetas de polipropileno. </li><li> La transferencia de embriones a través de una s...

<ol>
	<li>Schulte-Merker, S., Ho, R. K., Herrmann, B. G., N&#252;sslein-Volhard, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+protein+product+of+the+zebrafish+homologue+of+the+mouse+T-gene+is+expressed+in+nuclie+of+the+germ+ring+and+the+notochord+of+the+early+embryo.">The protein product of the zebrafish homologue of the mouse T-gene is expressed in nuclie of the germ ring and the notochord of the early embryo.</a> Development. 116, 1021-1027 (1992).</li><li>Jowett, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Double+in+situ+hybridization+techniques+in+zebrafish.">Double in situ hybridization techniques in zebrafish.</a> Methods. 23, 345-358 (2001).</li><li>J&#252;lich, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=beamter/deltaC+and+the+role+of+Notch+ligands+in+the+zebrafish+somite+segmentation,+hindbrain+neurogenesis+and+hypochord+differentiation.">beamter/deltaC and the role of Notch ligands in the zebrafish somite segmentation, hindbrain neurogenesis and hypochord differentiation.</a> Dev Biol. 286, 391-404 (2005).</li><li>Mara, A., Schroeder, J., Chalouni, C., Holley, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Priming,+Initiation+and+Synchronization+of+the+Segmentation+Clock+by+deltaD+and+deltaC.">Priming, Initiation and Synchronization of the Segmentation Clock by deltaD and deltaC.</a> Nat Cell Biol. 9, 523-530 (2007).</li><li>Lecuyer, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+analysis+of+mRNA+localization+reveals+a+prominent+role+in+organizing+cellular+architecture+and+function.">Global analysis of mRNA localization reveals a prominent role in organizing cellular architecture and function.</a> Cell. 131, 174-187 (2007).</li></ol>

El protocolo presentado aquí funciona bien con las sondas que dar una señal fuerte limpia después de la tinción de 30-45 minutos en una fosfatasa alcalina típica mediada por la reacción. Antes de realizar la fluorescencia en el protocolo de hibridación in situ, siempre prueba de nuestras sondas utilizando el estándar de protocolo no fluorescente (siempre en el material complementario junto con el protocolo de síntesis de la sonda). Hemos tenido menos éxito con los fluorescentes en el protocolo de hibridación ...

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<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Paraformaldehyde 16% solution, EM Grade</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Electron Microscopy Services</td>
<td>15710</td>
<td>Dilute to 4% in 1.33x PBS (final 1x). Store in 2ml aliquots at &#x2013;20&deg;C</td>
</tr>
<tr>
<td>Proteinase K, recombinant PCR grade</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roche</td>
<td>03115879001</td>
<td>Make a 20mg/ml stock solution in water. Store in 1ml aliquots at &#x2013;20&deg;C</td>
</tr>
<tr>
<td>Blocking Reagent</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roche</td>
<td>11096176001</td>
<td>Make a 10% stock solution in 1x maleic acid buffer. Store in 50ml aliquots at &#x2013;20&deg;C. Stable over multiple freeze/thaws.</td>
</tr>
<tr>
<td>Anti-Fluorescein-POD, Fab fragments</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roche</td>
<td>11426346910</td>
<td>Aliquot and store at -20&deg;C. Keep one working aliquot at 4&deg;C.</td>
</tr>
<tr>
<td>Anti-Digoxigenin-POD, Fab fragments</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roche</td>
<td>11207739910</td>
<td>As above.</td>
</tr>
<tr>
<td>TSA Plus Fluorescein system</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Perkin Elmer</td>
<td>NEL741001KT</td>
<td>Prepare each vial of TSA reagent only when needed. Dissolve in 60&mu;l DMSO. Store at 4&deg;C.</td>
</tr>
<tr>
<td>TSA Plus Cyanine5 system</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Perkin Elmer</td>
<td>NEL745001KT</td>
<td>As above</td>
</tr>
<tr>
<td>TSA Plus Cyanine3 system</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Perkin Elmer</td>
<td>NEL744001KT</td>
<td>As above</td>
</tr>
<tr>
<td>TSA Kit #16 AlexaFluor647 tyramide (plus HRP-goat-anti-rabbit IgG)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Molecular Probes /Invitrogen</td>
<td>T20926</td>
<td>Dissolve tyramide reagent in 150&mu;l DMSO, aliquot and store at &#x2013;20&deg;C.</td>
</tr>
<tr>
<td>RNase, DNase free</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roche</td>
<td>11119915001</td>
<td>Supplied as 500&mu;g/ml solution</td>
</tr>
<tr>
<td>Propidium Iodide</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Molecular Probes /Invitrogen</td>
<td>P-3566</td>
<td>Supplied as 1mg/ml solution in water.</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

zebrafish whole mount high-resolution double fluorescent in situ hybridization

Todo el montaje<em&gt; In situ</emHibridación&gt; es una de las técnicas más utilizadas en la biología del desarrollo. Aquí se presenta una alta resolución de doble fluorescente<em&gt; In situ</em&gt; Hibridación protocolo para el análisis del patrón de expresión precisa de un solo gen y para determinar la superposición de los dominios de expresión de dos genes. El protocolo es una versión modificada de la norma<em&gt; In situ</em&gt; Hibridación con fosfatasa alcalina y los sustratos tales como NBT / BCIP y Fast Red<sup&gt; 1,2</sup&gt;. Este protocolo utiliza sondas estándar digoxigenina y fluoresceína junto a la amplificación de la señal tyramide (TSA)<sup&gt; 3</sup&gt;. Los kits disponibles en el mercado TSA permite un diseño flexible experimental como la emisión de fluorescencia de color verde a rojo lejano se puede utilizar en combinación con diferentes manchas nucleares, como el yoduro de propidio, o inmunohistoquímica de fluorescencia de las proteínas. TSA produce un sustrato reactivo fluorescente que rápidamente se une covalentemente a restos, los residuos de tirosina general, en las inmediaciones de la riboprobe antisentido marcado. Los patrones de tinción resultantes son de alta resolución en que la localización subcelular de los ARNm se puede observar con microscopía confocal de barrido láser<sup&gt; 3,4</sup&gt;. Se puede observar transcripciones naciente en los loci cromosómicos, distinguir la tinción nuclear y citoplasmática y visualizar los patrones de otros, tales como la localización cortical del ARNm. Los estudios realizados en<em&gt; Drosophila</em&gt; Indican que aproximadamente el 70% de los ARNm muestran patrones específicos de la localización subcelular de que con frecuencia se correlacionan con la función de la proteína codificada<sup&gt; 5</sup&gt;. Cuando se combina con la reconstrucción por ordenador de conjuntos de datos 3D confocal, el protocolo permite el análisis detallado de la distribución del ARNm con resolución subcelular en embriones de los vertebrados conjunto.

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Zebrafish Whole Mount High-Resolution Double Fluorescent In Situ Hybridization

Todo el montaje hibridación in situ es una de las técnicas más utilizadas en la biología del desarrollo. Aquí se presenta una alta resolución de doble fluorescente en el protocolo de hibridación in situ para analizar el patrón de expresión precisa de un solo gen y para determinar la superposición de los dominios de expresión de dos genes. Se incluye un yoduro de propidio nuclear tinción de contraste para destacar la organización del tejido.

Pez cebra todo el montaje de alta resolución doble fluorescente In Situ La hibridación

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