Name: zebrafish whole mount high-resolution double fluorescent in situ hybridization
Uploaded: 2009-03-25T00:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Zebrafish Whole Mount High-Resolution Double Fluorescent In Situ Hybridization at JoVE.com

Vi vill tacka för bidragen från Dorthe Jülich, Jennifer runda och Andrew Mara i utvecklingen av detta protokoll. Forskningsstöd från NICHD, American Cancer Society och March of Dimes.

1. FIXERING <ol><li> Fix embryon över natten vid 4 ° C med 4% paraformaldehyd (PFA) i PBS. </li><li> Ta fixa och tvätta 2 x PBS, 5 minuter i rumstemperatur (RT). </li><li> Manuellt dechorionate embryon i PBS i ett glas depression tallrik med urmakare pincett. Efter dechorionation är embryon med hjälp av en brand-polerat glas pasteurpipett eftersom de kan hålla sig till polypropylen pipetter. </li><li> Överför embryon genom en serie av 25%, 50% och 75% metanol i PBS i 5 minuter vardera. </li><li> Byt vätska me...

<ol>
	<li>Schulte-Merker, S., Ho, R. K., Herrmann, B. G., N&#252;sslein-Volhard, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+protein+product+of+the+zebrafish+homologue+of+the+mouse+T-gene+is+expressed+in+nuclie+of+the+germ+ring+and+the+notochord+of+the+early+embryo.">The protein product of the zebrafish homologue of the mouse T-gene is expressed in nuclie of the germ ring and the notochord of the early embryo.</a> Development. 116, 1021-1027 (1992).</li><li>Jowett, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Double+in+situ+hybridization+techniques+in+zebrafish.">Double in situ hybridization techniques in zebrafish.</a> Methods. 23, 345-358 (2001).</li><li>J&#252;lich, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=beamter/deltaC+and+the+role+of+Notch+ligands+in+the+zebrafish+somite+segmentation,+hindbrain+neurogenesis+and+hypochord+differentiation.">beamter/deltaC and the role of Notch ligands in the zebrafish somite segmentation, hindbrain neurogenesis and hypochord differentiation.</a> Dev Biol. 286, 391-404 (2005).</li><li>Mara, A., Schroeder, J., Chalouni, C., Holley, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Priming,+Initiation+and+Synchronization+of+the+Segmentation+Clock+by+deltaD+and+deltaC.">Priming, Initiation and Synchronization of the Segmentation Clock by deltaD and deltaC.</a> Nat Cell Biol. 9, 523-530 (2007).</li><li>Lecuyer, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+analysis+of+mRNA+localization+reveals+a+prominent+role+in+organizing+cellular+architecture+and+function.">Global analysis of mRNA localization reveals a prominent role in organizing cellular architecture and function.</a> Cell. 131, 174-187 (2007).</li></ol>

Protokollet presenteras här fungerar bra med sonder som ger en ren stark signal efter färgning i 30-45 minuter i en typisk alkalisk fosfatas-medierad reaktion. Innan du utför fluorescent in situ hybridisering protokollet, testar vi alltid våra givare på det standardformulär icke fluorescerande protokoll (lämnas i kompletterande material tillsammans med sonden syntes protokoll). Vi har haft mindre framgång med fluorescent in situ hybridisering-protokollet när du använder svagare prober, men det kan vara möjlig...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Paraformaldehyde 16% solution, EM Grade</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Electron Microscopy Services</td>
<td>15710</td>
<td>Dilute to 4% in 1.33x PBS (final 1x). Store in 2ml aliquots at &#x2013;20&deg;C</td>
</tr>
<tr>
<td>Proteinase K, recombinant PCR grade</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roche</td>
<td>03115879001</td>
<td>Make a 20mg/ml stock solution in water. Store in 1ml aliquots at &#x2013;20&deg;C</td>
</tr>
<tr>
<td>Blocking Reagent</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roche</td>
<td>11096176001</td>
<td>Make a 10% stock solution in 1x maleic acid buffer. Store in 50ml aliquots at &#x2013;20&deg;C. Stable over multiple freeze/thaws.</td>
</tr>
<tr>
<td>Anti-Fluorescein-POD, Fab fragments</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roche</td>
<td>11426346910</td>
<td>Aliquot and store at -20&deg;C. Keep one working aliquot at 4&deg;C.</td>
</tr>
<tr>
<td>Anti-Digoxigenin-POD, Fab fragments</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roche</td>
<td>11207739910</td>
<td>As above.</td>
</tr>
<tr>
<td>TSA Plus Fluorescein system</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Perkin Elmer</td>
<td>NEL741001KT</td>
<td>Prepare each vial of TSA reagent only when needed. Dissolve in 60&mu;l DMSO. Store at 4&deg;C.</td>
</tr>
<tr>
<td>TSA Plus Cyanine5 system</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Perkin Elmer</td>
<td>NEL745001KT</td>
<td>As above</td>
</tr>
<tr>
<td>TSA Plus Cyanine3 system</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Perkin Elmer</td>
<td>NEL744001KT</td>
<td>As above</td>
</tr>
<tr>
<td>TSA Kit #16 AlexaFluor647 tyramide (plus HRP-goat-anti-rabbit IgG)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Molecular Probes /Invitrogen</td>
<td>T20926</td>
<td>Dissolve tyramide reagent in 150&mu;l DMSO, aliquot and store at &#x2013;20&deg;C.</td>
</tr>
<tr>
<td>RNase, DNase free</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roche</td>
<td>11119915001</td>
<td>Supplied as 500&mu;g/ml solution</td>
</tr>
<tr>
<td>Propidium Iodide</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Molecular Probes /Invitrogen</td>
<td>P-3566</td>
<td>Supplied as 1mg/ml solution in water.</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

zebrafish whole mount high-resolution double fluorescent in situ hybridization

Hela montera<em&gt; På plats</em&gt; Hybridisering är en av de mest använda teknikerna i utvecklingsbiologi. Här presenterar vi en högupplöst dubbla lysrör<em&gt; På plats</em&gt; Hybridisering protokoll för att analysera den exakta uttrycket mönster av en enda gen och för att bestämma överlappningen av uttrycket domäner två gener. Protokollet är en modifierad version av standarden<em&gt; På plats</em&gt; Hybridisering med hjälp av alkalisk fosfatas och substrat som NBT / BCIP och Fast Red<sup&gt; 1,2</sup&gt;. Detta protokoll använder standard digoxygenin och fluorescein märkta prober tillsammans med tyramide signalförstärkning (TSA)<sup&gt; 3</sup&gt;. Den kommersiellt tillgängliga TSA kit möjliggöra en flexibel experimentell design som fluorescens utsläpp från grönt till långt-röd kan användas i kombination med olika nukleära fläckar, som propidiumjodid, eller fluorescens immunohistokemi för proteiner. TSA producerar en reaktiv fluorescerande substrat som snabbt kovalent binder till beståndsdelarna typiskt tyrosin rester, i omedelbar närhet av den märkta antisens riboprobe. Den resulterande färgningsmönster är högupplösta i subcellulära lokalisering av mRNA kan observeras med hjälp av laserskanning konfokalmikroskopi<sup&gt; 3,4</sup&gt;. Man kan observera begynnande avskrifter vid kromosomala loci, skilja nukleära och cytoplasmisk färgning och visualisera andra mönster som kortikala lokalisering av mRNA. Studier i<em&gt; Drosophila</em&gt; Indikerar att ungefär 70% av mRNA uppvisar specifika mönster av subcellulära lokalisering som ofta korrelerar med funktion protein som bildas<sup&gt; 5</sup&gt;. I kombination med datorstödd rekonstruktion av 3D konfokala dataset, gör att våra protokoll en detaljerad analys av mRNA distribution med sub-cellulära upplösning i hela ryggradsdjur embryon.

Watch this Scientific Journal Video about Zebrafish Whole Mount High-Resolution Double Fluorescent In Situ Hybridization at JoVE.com

Zebrafish Whole Mount High-Resolution Double Fluorescent In Situ Hybridization

Hela montera in situ hybridisering är en av de mest använda teknikerna i utvecklingsbiologi. Här presenterar vi en högupplöst dubbel fluorescent in situ hybridisering protokollet för att analysera den exakta uttrycket mönster av en enda gen och för att bestämma överlappningen av uttrycket domäner två gener. Vi inkluderar en propidiumjodid kärnvapen mot-bets för att markera vävnad organisation.

Zebrafisk Hela Mount högupplöst Dubbel Fluorescerande In Situ Hybridisering

Whole mount in situ hybridization is one of the most widely used techniques in developmental biology.  Here, we present a high-resolution double ...

Research

JoVE Journal

Biology

Zebrafish Whole Mount High-Resolution Double Fluorescent In Situ Hybridization

Double Whole Mount in situ Hybridization of Early Chick Embryos

Dubbel Hela Montera in situ hybridisering för tidig kycklingembryon

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

Method for Whole Mount Antibody Staining in Chick

Metod för hela berget antikropp färgning i Chick

Using Whole Mount in situ Hybridization to Link Molecular and Organismal Biology

Using Whole Mount in situ Hybridization to Link Molecular and Organismal Biology

Använda Hela Mount På plats Hybridisering till Link Molekyl-och organismbiologi

Whole mount in situ hybridization (WISH) is a common technique in molecular biology laboratories used to study gene expression through the localization of ...

Polarized Translocation of Fluorescent Proteins in Xenopus Ectoderm in Response to Wnt Signaling

Polarized Translocation of Fluorescent Proteins in Xenopus Ectoderm in Response to Wnt Signaling

Polariserade flyttning av fluorescerande proteiner i Xenopus Ektoderm som svar på Wnt Signaling

Cell polarity is a fundamental property of eukaryotic cells that is dynamically regulated by both intrinsic and extrinsic factors during embryonic ...

Whole Mount in Situ Hybridization of E8.5 to E11.5 Mouse Embryos

Whole Mount in Situ Hybridization of E8.5 to E11.5 Mouse Embryos

Hela berget<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisering av E8.5 till E11.5 musembryon

Whole mount in situ hybridization is a very informative approach for defining gene expression patterns in embryos. The in situ hybridization procedures ...

Analysis of Single-cell Gene Transcription by RNA Fluorescent In Situ Hybridization (FISH)

Analysis of Single-cell Gene Transcription by RNA Fluorescent In Situ Hybridization FISH

Analys av encelliga gentranskription av RNA-lysrör<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisering (FISH)

Adhesion of Plasmodium falciparum infected erythrocytes (IE) to human endothelial receptors during malaria infections is mediated by expression of PfEMP1 ...

Chromosome Replicating Timing Combined with Fluorescent In situ Hybridization

Chromosome Replicating Timing Combined with Fluorescent In situ Hybridization

Kromosom Replikera Timing kombination med fluorescerande<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisering

Mammalian DNA replication initiates at multiple sites along chromosomes at different times during S phase, following a temporal replication program. The ...

Whole Mount RNA Fluorescent in situ Hybridization of Drosophila Embryos

Whole Mount RNA Fluorescent in situ Hybridization of Drosophila Embryos

Hel Mount RNA Lysrör<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisering av<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryon

Assessing  the expression pattern of a gene, as well as the subcellular localization  properties of its transcribed RNA, are key features for ...

RNA In situ Hybridization in Whole Mount Embryos and Cell Histology Adapted for Marine Elasmobranchs

RNA In situ Hybridization in Whole Mount Embryos and Cell Histology Adapted for Marine Elasmobranchs

RNA<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisering i hela Mount Embryon och Cell Histologi Anpassad för marina Elasmobranchii

Marine  elasmobranchs are valued animal models for biomedical and genomic studies as  they are the most primitive vertebrates to have adaptive immunity ...

High Resolution Whole Mount In Situ Hybridization within Zebrafish Embryos to Study Gene Expression and Function

High Resolution Whole Mount In Situ Hybridization within Zebrafish Embryos to Study Gene Expression and Function

Hög upplösning Hela Mount<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisering inom Zebrafish embryon för att studera genuttryck och funktion

This article focuses on whole-mount in situ hybridization (WISH) of zebrafish embryos. The WISH technology facilitates the assessment of gene expression ...