Name: focal ca2+ transient detection in smooth muscle
Uploaded: 2009-06-29T00:00:00
Duration: 17 min 41 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Focal Ca2+ Transient Detection in Smooth Muscle at JoVE.com

وفرت الدعم المالي ويلكوم ترست (جائزة لكبار الشخصيات وJSY 074128 زمالة بحوث لKLB). مجلس البحوث الطبية دراسية للRJA ويستند Leica_SP2_Stacker ، خوارزمية تستخدم لاستيراد المشاجرات ل &#39;إعادة البناء&#39; في سلسلة ، على Leica_tiff_sequence المساعد لايكا SP2 قراءة في ImageJ المشاجرات ، التي وضعها توني كولينز واستخدامها بإذنه. ( <a href="http://www.uhnres.utoronto.ca/facilities/wcif/software/Plugins/LeicaTIFF.html">http://www.uhnres.utoronto.ca/facilities/wcif/software/Plugins/LeicaTIFF.html</a> ) StackReg وTurboReg ، تستند الخوارزميات المستخدمة لتصحيح حركة الأنسجة ، وعلى venaz ث وزملاؤه (1998) 9. وقد كتب Excel_writer.jar بواسطة كورت دي فوس (http://rsb.info.nih.gov/ij/plugins/excel-writer.html). ويستند JNCT0.08JoVE.ijm ، الخوارزمية الكشف عن الجسيمات ، على خوارزمية كتبه الدماغ كوالا لمبور ومفصلة من قبل 5.

الجزء 1 : إعداد كا 2 + المؤشر (اوريغون الأخضر 488 - BAPTA 01:00) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أوريغون الخضراء BAPTA 488 - 1 يأتي في 500 قارورة AM ميكرولتر وكمية صغيرة (50 ميكروغرام) من مسحوق. إضافة Pluronic 40 ميكرولتر F - 127 حل لمسحوق ، والهز برفق لمدة 30 ثانية ، ثم يضاف 460 PSS ميكرولتر ، ويهز بلطف لمدة 30 ثانية. الحل النهائي ، و 10 ميكرومتر أوريغون الخضراء BAPTA 488 - 1 صباحا ، ويوفر 4 × 125 aliquots ميكرولتر. تجنب التعرض للضوء وتخزينها على سي -20 </li></ol> الجزء 2 : كا 2 + التحميل <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة المؤشر + كا 2 (ولاية أوريغون الأخضر 488 - BAPTA 1:00) من التجميد (-20 م) والسماح لذوبان الجليد في درجة حرارة الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أخذ 1 مل من جهاز الأمن الوقائي في أنبوب اختبار وضعها في حمام ماء. يا فقاعة مع 95 ٪ 05/02 ٪ CO 2 بمعدل حوالي 1 فقاعة الظهور في الثانية الواحدة. عوامات ويجب أن يكون المضمون في أنبوب اختبار ، وعلى سبيل المثال مع كدر أو مع Parafilm. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تشريح الأنسجة من الحيوانات ، وطبق بيتري Sylgard مبطنة ، وإزالة بعناية النسيج الضام. بغض النظر عن نوع الجهاز العضلات الملساء ، ينبغي الاستعاضة عن كل PSS دقائق (10) ويجب غسلها جيدا الأنسجة (على سبيل المثال عن طريق استبدال جهاز الأمن الوقائي ثلاث مرات) تشريح التالية. لالأسهر : النظر في قطع الجهاز طول الطرق لإنتاج ورقة من الأنسجة. لالمثانة البولية : فتح طوليا من عنق المثانة (الخلفي) على الجزء العلوي من القبة (الأمامية). إعداد أربعة شرائط ، 6 -- 8 مم طويلة و 1 -- 2 ملم واسعة ، على طول السطح الظهري للالنافصة ، وقطع في اتجاه الحزم العضلات المهيمنة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مكان تشريح الأنسجة في جهاز الأمن الوقائي &quot;ما قبل تحسنت وانفجر&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 125 ميكرولتر من 10 ميكرومتر أوريغون الخضراء BAPTA - 488 1:00 إلى أنبوب اختبار ويعطي يهز قليلا ، من جهة ، وإلى مزيج. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استئناف محتدما ويترك ، مع تغطية احباط. الوقت المستغرق لأنسجة كافية لتناول الكالسيوم 2 + مؤشر يتفاوت مع حجم الأنسجة وسماكة طبقة العضلات الملساء. على سبيل المثال : 70 دقيقة (الماوس النافصة ، anococcygeus الجرذان) إلى 120 دقيقة (النافصة الجرذ ، الفأر الأسهر). </li></ol> الجزء 3 : إعداد &quot;كا 2 + تحميل&#39; الأنسجة للفحص المجهري حذرا من النسيج تعلق أمر ضروري من أجل تقليل حركة عفوية من النسيج (خاصية التصوير من خلايا العضلات الملساء من الأنسجة سليمة نسبيا) ، وتيسير موقع موقع مناسب للتصوير (كما شقة قطعة من النسيج قد يكون الاستطلاع في بعدين ، بدلا من ثلاثة). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شطف الأنسجة في PSS انفجر ما لا يقل عن 5 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جبل في إعداد طبق Sylgard مبطنة ، وتمتد إلى الأنسجة (قليلا) لتشكيل ورقة مسطحة. تجنب استخدام الطويل &quot;دبابيس&quot; التي قد تخدش الهدف ، واستخدام أطوال قصيرة بدلا من 25-50 ميكرون قطر الأسلاك الفضية ب &quot;دبابيس&quot; وتدرج في زاوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> موقف إعداد طبق على المسرح المجهر ، والحرص على التأكد من أن PSS لا الهروب من منطقة Sylgard مبطنة للطبق (لأن هذا قد يؤدي إلى تغطية منطقة كبيرة يجري في جهاز الأمن الوقائي ، وعندما يبدأ superfusion). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التبديل على مضخة من أجل إعداد superfuse مع PSS. غالبا ما يتم توظيف نسبة 100 مل للساعة الواحدة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التبديل في وحدة تدفئة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع أنابيب تدفق وتدفق ، والتحقيق في درجة الحرارة على طبق التحضير (لصق كل لقطاع المعادن بواسطة المغناطيس على قاعدتها). فإن ارتفاع غيض من أنبوب تدفق تحديد عمق PSS. توخي الحذر لضمان تدفق هو في الواقع إزالة PSS (كما هو الحال في بعض الأحيان ليس في البداية). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضبط درجة الحرارة في وحدة سخان للوصول إلى درجة الحرارة المطلوبة ، على سبيل المثال 33-35 C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> السماح للتوازن الأنسجة لا يقل عن 10 دقيقة. </li></ol> الجزء 4 : اختيار موقع لصورة التعرض للإضاءة والإثارة photobleach المؤشر ، وبالتالي تجنب استخدام أكثر من بضع ثوان في كل مرة. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مع هدف منخفضة الطاقة (10X أو 20X) استخدام epifluorescence ومثيرة مع ضوء أزرق ، لعرض العضلات الملساء ، وتحديد منطقة مناسبة لمراقبته. محاولة لاختيار الموقع على أساس : الحركة (التي يجب أن يكون الحد الأدنى) ، وعدد خلايا العضلات الملساء في هذا المجال. &quot;هياكل&quot; مشرق قد يسبب عددا كبيرا من &quot;ايجابيات كاذبة&quot; في صورة خوارزمية الكشف ، وبالتالي تجنب المواقع التي تحتوي على أعداد كبيرة من الخلايا (على سبيل المثال) أو الظهارية يتخلل الليفية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التحول إلى هدف أكبر من الطاقة (40X). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تدوير مرحلة أو المحور البصري حتى الخلية العضلات الملساء (ق) وتقع الأفقية (الموازية للمحور أي مسح سريع). </li></ol> الجزء 5 : متحد البؤر المجهري تفاصيل عن كيفية &quot;إعداد&quot; المجهر مبائر محددة لكل نوع المجهر ، ولكنالاعتبارات الرئيسية هي : السرعة (هو الحد الأدنى المطلوب من 5 هرتز لمعظم العابرين كا + 2) ، والقرار وحجم الحقل (وكلاهما يتاجر حالا مع السرعة). بعض بروتوكول التالية محددة إلى مجهر لايكا SP2 مبائر تستقيم. بروتوكول نموذجي هو : 100 سلسلة الإطار ، حصلت على 5 هرتز (256 × 256 بكسل ، حوالي 100 × 100 ميكرون) أو 13.5 هرتز (256 × 64 بكسل ؛ حوالي 100 × 25 ميكرون). رئيس مجموعة مسح للتحرك ثنائي إتجاهي (لتحقيق أقصى قدر من السرعة الاستحواذ) والحصول على 1000 هرتز في كل سطر. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إغلاق الثقب إلى &quot;القرص مهواة&#39; واحد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مجموعة ليزر (488 نانومتر) على السلطة بين 25 و 35 ٪ على AOTF ؛ هذه القيمة هي مفاضلة بين السطوع وphotobleaching. (وهذا الأخير هو مشكلة خاصة خلال تسجيلات طويلة.) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحصول على ست مجموعات في كل موقع ، و4-6 في مواقع &quot;المعاملة&quot;. انها لهدف مشترك لمراقبة نفسه قبل ستة مواقع للمخدرات (&quot;السيطرة&quot; على سبيل المثال) وآخر من المخدرات ، على الرغم من photobleaching كبيرة قد يسبب المجرب لتحيد عن ذلك. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فمن الضروري مع كا 2 + التصوير التي يتم تنفيذها &quot;ضوابط الوقت&quot;. </li></ol> الجزء 6 : إعداد لتحليل <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحميل وتثبيت صورة من J : http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html. تحميل النسخة منصة محددة ، ومن ثم التحديث إلى أحدث إصدار عن طريق تحميل أحدث ملف imageJ.jar من http://rsb.info.nih.gov/ij/upgrade/ij.jar ، ليحل محل الملف القديم. التفاح مستخدمي ماك : إذا كان يعمل ببطء ، تأكد من أنك تستخدم أحدث إصدار من الجهاز الظاهري جافا (JVM) متوفرة من Apple (http://www.apple.com/macosx/features/java/). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحميل Excel_writer.jar من : http://rsb.info.nih.gov/ij/plugins/excel-writer.html وتثبيت الإضافات في [الدليل] جرة&gt; الدليل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نسخ الملفات التالية إلى الدليل الإضافات : Leica_SP2_Stacker.class ؛ JNCT0.08Release.ijm. تثبيت كل من هذه البرامج النصية باستخدام الإضافات [القائمة]&gt; وحدات الماكرو تثبيت &lt;... ImageJ ظيفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نستخدم المجهر لايكا مبائر SP2 ، البرنامج (لايكا LCS) الذي يولد كل سلسلة ك &quot;فيلم&quot; واحد للعرض داخل البرنامج ، ولكن كما يوفر الأطر الفردية. لإعادة بناء الأطر في سلسلة : (ط) تأكد من أن كل &quot;إطارات&quot; من أجل إعادة بنائها في مجلد واحد (مثل &#39;DataFolder&gt; المشاجرات&#39;). (ثانيا) حدد الإضافات [القائمة]&gt; وحدات الماكرو&gt; Leica_SP2_Stacker. حدد الدليل الجذر (على سبيل المثال &#39;DataFolder&#39;). حدد المجلد المطلوب من القائمة المنسدلة (&#39;المشاجرات /&#39; مثلا). حدد الدليل الإخراج أو إنشاء واحدة جديدة (&#39;DataFolder&gt; الأكوام&quot; مثلا). البرنامج النصي ثم إعادة بناء سلسلة من الأطر الفردية. </li></ol> الجزء 7 : تصحيح للحركة رغم أنه قد يكون مصغرا الحركة من موقع تصوير مع يعلقون جيدة والأنسجة بالتساوي طاقتها ، وبعض الأجهزة تقلصات العضلات الملساء المعرض العفوية التي لا يمكن إلغاؤها من جانب الحذر تعلق وحدها. نحن هنا وصف استخدام خوارزمية متاحة بحرية أن تؤيد أو إطارات مباريات ضمن سلسلة. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنزيل &quot;StackReg&#39; (http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/) و &quot;TurboReg&#39; (http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/turboreg/). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تثبيت كل الإضافات إلى الدليل باستخدام الإضافات&gt; وحدات الماكرو تثبيت &lt;... </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحميل كدسة بحيث تتم معالجتها (ملف&gt; فتح...) ونقل بعد ذلك إلى الإطار الذي يظهر بوضوح في مجال الاهتمام. وسوف تكون محاذاة الإطارات الأخرى في هذا الإطار المرجعي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الإضافات&gt; مداخن&gt; StackReg. حاول كل من &quot;التحولات&quot; مختلفة (أي الترجمة ، هيئة جامدة ، تناوب مقيس ، أفيني) لتحديد ما هو الأكثر فعالية. (مزيد من التفاصيل : http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/) </li></ol> الجزء 8 : الجسيمات خوارزمية الكشف لكل &quot;موقع&quot; المصورة ، وسوف تختلف العوامل التي تؤثر على الكشف عن كا 2 + العابرين. من خلال قياس بعض خصائص كل موقع (&#39;المعلمات الجسيمات&#39; -- مفصلة أدناه) ، مما يسهل عملية الكشف. وهكذا في كل موقع ، واحد يحسب &#39;عتبة طرح&#39; ، &#39;الحد الأدنى لنسبة&quot; و &quot;عتبة حافة الخلية. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الإضافات [القائمة]&gt; وحدات الماكرو&gt; تثبيت... ثم اختر &quot;JNCT0.08Release.ijm. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الإضافات [القائمة] تحميل&gt;&gt; وحدات الماكرو المكدس (اختصار : لتر). حدد سلسلة وحساب المعلمات الجسيمات : <ol style="list-style:none;;text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أ. عتبة لطرح (= الخلفية) </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد عائد الاستثمار مستطيلة على ما كنت تعتقد أن &#39;خلفية&#39;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قياس (اختصار : م). يدون يعني. <ol style="list-style:none;;text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ب. حساب الحد الأدنى لنسبة </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حدد مستطيلالعائد على الاستثمار في جميع أنحاء منطقة مسطحة بصريا من الخلية (ق). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قياس (اختصار : م). علما الانحراف إلى أسفل وقياسية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مزيد من تكرار مرتين أو يمكنك رسم ثلاثة صناديق في آن واحد عن طريق الضغط على &quot;التحول&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حساب ويدون عتبة نسبة = (1 + SD / الوسط) × 32 ، بمتوسط ​​القيم من ثلاثة مكررات / المواقع. <ol style="list-style:none;text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ج. خلية حافة عتبة </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> صورة&gt; مداخن&gt; Z المشروع... اختيار نوع الإسقاط : &quot;كثافة متوسط&#39; </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> صورة&gt; ضبط&gt; العتبة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حدد الأبيض والأسود. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعريف &quot;ضمن&quot; (التمرير العلوي) والحد من انخفاض قيمة علما المقابلة (على يمين شريط التمرير). وسيتم احتساب فقط الأحداث التي تحدث في مناطق السود. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> انقر على &quot;إعادة&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحليل المداخن (اختصار : 2) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ما عليك سوى اختيار سلسلة واحدة في هذه المرحلة ، أي &quot;الملف الأول&quot; و &quot;الملف الأخير&quot; يجب أن تكون هي نفسها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أدخل قيم &quot;عتبة طرح&#39; &#39;عتبة نسبة&#39; ، و &#39;عتبة حافة الخلية. ترك الإعدادات الأخرى في قيمها الافتراضية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وسوف تنتج الخوارزمية إطار ثنائي في الجزء الذي يظهر في سلسلة معالجتها على اليسار وعلى اليمين الأصلي. من خلال هذا الانتقال بعناية لتقييم عدد من ايجابيات كاذبة والمناسبات التي لم تكن الأحداث ، مرئية بالعين ، تم الكشف عنها. للحصول على كشف أدق من كا 2 + العابرين قد يكون من الضروري تعديل طفيف على بعض من &#39;المعلمات الجسيمات. في حين أن العملية قد تبدو &quot;ضرب وتفوت&quot; قليلا في المحاولة الأولى ، واحد يحصل بسرعة على ما يشعر المعلمات الرئيسية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لكل سلسلة ، الخوارزمية ينتج ملف Excel الذي تفاصيل خصائص الحدث الكشف (مثل المنطقة ، وموقف السعة). &quot;ايجابيات كاذبة&quot; -- التي تم تحديدها من خلال مراجعة ملفات الصور التي النواتج الخوارزمية (مثل الخطوة 8.17) -- يمكن إزالتها ، من جهة ، وهذا من ملف Excel. </li></ol>

<ol>
	<li>Haugland, R. P., Gregory, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Indicators+for+Ca2+,+Mg2+,+Zn2++and+other+metal+ions.">Indicators for Ca2+, Mg2+, Zn2+ and other metal ions.</a> Handbook of fluorescent probes and research products. , 771-826 (2002).</li><li>Boland, B., Himpens, B., Gillis, J. M., Casteels, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relationship+between+force+and+Ca2++in+anococcygeal+and+vas+deferens+smooth+muscle+cells+of+the+mouse.">Relationship between force and Ca2+ in anococcygeal and vas deferens smooth muscle cells of the mouse.</a> Pflugers Arch. 421, 43-51 (1992).</li><li>Hashitani, H., Fukuta, H., Takano, H., Klemm, M. F., Suzuki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Origin+and+propagation+of+spontaneous+excitation+in+smooth+muscle+of+the+guinea-pig+urinary+bladder.">Origin and propagation of spontaneous excitation in smooth muscle of the guinea-pig urinary bladder.</a> J Physiol. 150, 273-286 (2001).</li><li>Heppner, T. J., Bonev, A. D., Nelson, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elementary+purinergic+Ca2++transients+evoked+by+nerve+stimulation+in+rat+urinary+bladder+smooth+muscle.">Elementary purinergic Ca2+ transients evoked by nerve stimulation in rat urinary bladder smooth muscle.</a> J. Physiol. 564, 201-212 (2005).</li><li>Brain, K. L., Jackson, V. M., Trout, S. J., Cunnane, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intermittent+ATP+release+from+nerve+terminals+elicits+focal+smooth+muscle+Ca2++transients+in+mouse+vas+deferens.">Intermittent ATP release from nerve terminals elicits focal smooth muscle Ca2+ transients in mouse vas deferens.</a> J. Physiol. 541, 849-862 (2002).</li><li>Fleichman, M., Schneider, T., Fetscher, C., Michel, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signal+transduction+underlying+carbachol-induced+contraction+of+rat+urinary+bladder+II.+Protein+kinases.">Signal transduction underlying carbachol-induced contraction of rat urinary bladder II. Protein kinases.</a> J. Pharmacol. Exp. Ther. 308, 54-58 (2004).</li><li>Young, J. S., Meng, E., Cunnane, T. C., Brain, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spontaneous+purinergic+neurotransmission+in+the+mouse+urinary+bladder.">Spontaneous purinergic neurotransmission in the mouse urinary bladder.</a> J. Physiol. 586, 5743-5755 (2008).</li><li>Nelson, M. T., Cheng, H., Rubart, M., Santana, L. F., Bonev, A. D., Knot, H. J., Lederer, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relaxation+of+arterial+smooth+muscle+by+calcium+sparks.">Relaxation of arterial smooth muscle by calcium sparks.</a> Science. 270, 633-637 (1995).</li><li>Th&#233;venaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+pyramid+approach+to+subpixel+registration+based+on+intensity.">A pyramid approach to subpixel registration based on intensity.</a> IEEE Trans. Image Process. 7, 27-41 (1998).</li></ol>

وبذلت جهود لتقليل عدد الحيوانات المستخدمة ومعاناتهم ، وأجريت التجارب في جميع وفقا للحيوانات المملكة المتحدة (الإجراءات العلمية) عام 1986 وقانون المجتمعات الأوروبية توجيه المجلس 86/09/EEC.

اختيار الفلورسنت كا 2 + مؤشر أوريغون الخضراء BAPTA 488 - 1 حيث تم اختيار AM كا 2 + المؤشر لأنه (ط) هو مشرق مقارنة بالمؤشرات الأخرى (مثل Fluo - 4 والأخضر الكالسيوم) 1 ؛ تركيز + (ب) هو حساسية للتغيرات فسيولوجية في كا 2 مع د K حجم مماثل من 1 إلى داخل الخلايا كا 2 + تركيز [كا 2 +] ط (مثلا الأسهر 2) ، (الثالث) يحمل الكثير من خلايا العضلات الملساء ، مما السلس اقتران الخلايا العضلية ليتم رصدها. ومع ذلك ، ولاية أوريغون الخضراء BAPTA - 488 01:00 هو غير ratioable كا 2 + المؤشر ، ولا يمكن بسهولة مثل استخدامها لتحديد المطلق [كا 2 +] ط. وعلاوة على ذلك ، فإنه قد العازلة أيضا كا 2 + اذا كان حاضرا في تركيزات عالية وتصبح مشبعة مع التغيرات في السعة العالية [كا 2 +] ط. تثبيط انقباض عفوية قد يكون خفض انقباض عفوية الأجهزة العضلات الملساء عقاقيري ، مثل حظر حركة كا 2 + من خلال نوع L - كا 2 + قنوات (مثلا : النيفيديبين 3 ؛ ديلتيازيم 4). علما أن هذه الأدوية سوف يقلل كثيرا من سعة كامل الخلية كا 2 + ومضات / العابرين. تقلص الأسهر النتائج من مزيج من النقل العصبي في المقام الأول وpurinergic noradrenergic. تنسيق كا 2 + العابرين في هذه الأنسجة ، ولكن ، حساسة للحصار مستقبلات noradrenergic (مثلا α 1 الأدرينية ، التي برازوسين 5) حتى يمكن تقليل الحركة دون أن يؤثر ذلك التنسيق كا 2 + العابرين. بدلا من ذلك ، قد يتم منع الانكماش &#39;المصب&#39; عن طريق تثبيط ضوء سلسلة الميوسين مثل كيناز بواسطة wortmannin 6. الاستنتاجات رصد كا 2 + مضان في القرار submicron هي تقنية قوية لدراسة آثار ما بعد الإفراج صلي 5،7 العصبي ، والإفراج عن كا 2 + من مخازن الداخلية (مثل &quot;الشرارات&quot; 8). تحليل كا 2 + العابرين باستخدام المنهجية المذكورة هنا هي فعالة من حيث التكلفة مقارنة المتاحة تجاريا حزم ويسمح تحليل الصور مصممة خصيصا من خلال تحليل الإضافات جافا مخصصة لكتابة ImageJ.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Oregon Green 488 BAPTA-1 AM</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>O6807</td>
<td>10 x 50 &mu;g</td>
</tr>
<tr>
<td>Pluronic F-127 solution</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>P3000MP</td>
<td>20% solution in DMSO</td>
</tr>
<tr>
<td>Leica SP2 upright confocal microscope</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Leica</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Air table (&#x2018;vibration isolated workstation&#x2019;)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Newport</td>
<td>M-VW-3046-OPT-012140</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sylgard 184 elastomer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Dow Corning</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

focal ca2+ transient detection in smooth muscle

كاليفورنيا 2 + التصوير من العضلات الملساء ، رؤية ثاقبة الآليات الخلوية التي قد لا تسفر عن تغييرات محتملة في الغشاء ، مثل الافراج عن كا 2 + من مخازن الداخلية ، ويسمح لخلايا متعددة في وقت واحد يمكن رصدها لتقييم ، على سبيل المثال ، في اقتران المخلوي الأنسجة. التحت خلوية كا 2 + العابرين شائعة في العضلات الملساء ، ولكن يصعب قياسها بدقة بسبب المشاكل الناجمة عن وقوعها العشوائية ، أكثر من حقل واسع في كثير من الأحيان من العرض ، في الجهاز الذي يجعله عرضة للتعاقد. للتغلب على هذه المشكلة ، قمنا بتطوير سلسلة من البروتوكولات والتصوير الروتينية للحصول على تحليل ومن ثم تحليلها ، وبطريقة آلية ، والتردد ، والموقع والسعة من مثل هذه الأحداث. بينما يمكن تطبيق هذا النهج في سياقات أخرى ، عملنا يشمل الكشف عن purinergic كا 2 + العابرين المحلية لتحديد مواقع اطلاق سراح الارسال مع القرار submicron. ATP يتم تحريرها باعتبارها cotransmitter من الأعصاب اللاإرادية ، حيث يربط P2X1 المستقبلات في العضلات الملساء للالنافصة والأسهر. كاليفورنيا 2 + يدخل العضلات الملساء ، مما أدى إلى purinergic neuroeffector العابرين كا + 2 (NCTs). الاتصال كا 2 + العابرين تسمح برصد البصرية الإفراج العصبي بطريقة العديد من المزايا أكثر من الكهربية. وبصرف النظر عن القرار المكانية تحسنت كثيرا ، وتسجيل البصرية لديه ميزة إضافية تتمثل في السماح للتسجيل من مواقع الارسال الافراج مميزة كثيرة في وقت واحد. وعلاوة على ذلك ، فإن الطائرة الضوئية التركيز هو أسهل للحفاظ على أو تصحيح خلال سلسلة طويلة من تسجيل هو ضعيتها microelectrode an حادة داخل الخلايا. باختصار ، هو وضع الخطوط العريضة لطريقة التصوير من كا 2 + مضان الذي تفاصيل إعداد الأنسجة ، واقتناء وتحليل البيانات. نحن مخطط استخدام البرامج النصية عدة لتحليل مثل الكالسيوم 2 + العابرين.

Watch this Scientific Journal Video about Focal Ca2+ Transient Detection in Smooth Muscle at JoVE.com

Focal Ca2+ Transient Detection in Smooth Muscle

تفاصيل أساليب عالية الدقة كا<sup&gt; 2 +</sup&gt; التصوير من العضلات الملساء داخل أجهزة معزولة ، ومنها : التحضير لاكتساب صورة من الأنسجة ، وتحليل البيانات.

تنسيق كا 2 + الكشف العابر في العضلات الملساء

Ca2+ imaging of smooth muscle provides insight into cellular mechanisms that may not result in changes of membrane potential, such as the release of Ca2+ ...

Research

JoVE Journal

Biology

Focal Ca2+ Transient Detection in Smooth Muscle

Isolation of Human Umbilical Arterial Smooth Muscle Cells (HUASMC)

Isolation of Human Umbilical Arterial Smooth Muscle Cells HUASMC

عزل الشريان السري الإنسان خلايا العضلات الملساء (HUASMC)

The human umbilical cord (UC) is a biological sample that can be easily obtained just after birth. This biological sample is, most of the time, discarded ...

Exploring Arterial Smooth Muscle Kv7 Potassium Channel Function using Patch Clamp Electrophysiology and Pressure Myography

استكشاف الشرياني العضلات الملساء قناة البوتاسيوم Kv7 الدالة باستخدام المشبك التصحيح الكهربية وتخطيط العضل الضغط

Contraction  or relaxation of smooth muscle cells within the walls of resistance arteries  determines the artery diameter and thereby controls flow of ...

Isolation of Pulmonary Artery Smooth Muscle Cells from Neonatal Mice

عزل الشريان الرئوي خلايا العضلات الملساء من الفئران حديثي الولادة

Pulmonary hypertension is a significant cause of morbidity and mortality in infants. Historically, there has been significant study of the signaling ...

Measurement of Smooth Muscle Function in the Isolated Tissue Bath-applications to Pharmacology Research

قياس السلس وظيفة العضلات في الأنسجة المعزولة حمام تطبيقات لأبحاث الصيدلة

Isolated tissue bath assays are a classical pharmacological tool for evaluating concentration-response relationships in a myriad of contractile tissues.  ...

Two-photon Imaging of Intracellular Ca2+ Handling and Nitric Oxide Production in Endothelial and Smooth Muscle Cells of an Isolated Rat Aorta

Two-photon Imaging of Intracellular Ca2+ Handling and Nitric Oxide Production in Endothelial and Smooth Muscle Cells of an Isolated Rat Aorta

التصوير ثنائي الفوتون من الكالسيوم داخل الخلايا<sup&gt; 2+</sup&gt; المناولة واكسيد النيتريك الإنتاج في البطانية وخلايا العضلات الملساء لعزل الجرذ الأبهر

Calcium is a very important regulator of many physiological processes in vascular tissues. Most endothelial and smooth muscle functions highly depend on ...

Measurement of Calcium Fluctuations Within the Sarcoplasmic Reticulum of Cultured Smooth Muscle Cells Using FRET-based Confocal Imaging

التصوير متحد البؤر قياس التقلبات الكالسيوم داخل الهيولى العضلية شبكية من مثقف خلايا العضلات الملساء عن طريق الحنق المستندة إلى

Maintenance of steady-state calcium (Ca2+) levels in the sarcoplasmic reticulum (SR) of vascular smooth muscle cells (VSMCs) is vital to their overall ...

Isolation of Murine Coronary Vascular Smooth Muscle Cells

عزل الفئران التاجي الأوعية الدموية خلايا العضلات الملساء

While the isolation and culture of vascular smooth muscle cells (VSMCs) from large vessels is well established, we sought to isolate and culture VSMCs ...

Murine Aortic Crush Injury: An Efficient In Vivo Model of Smooth Muscle Cell Proliferation and Endothelial Function

Murine Aortic Crush Injury: An Efficient In Vivo Model of Smooth Muscle Cell Proliferation and Endothelial Function

الفئران الأرواح سحق إصابة: كفاءة<em&gt; في فيفو</em&gt; نموذج من انتشار الخلايا العضلية السلس والوظيفة البطانية

Arterial reconstruction, whether angioplasty or bypass surgery, involves iatrogenic trauma causing endothelial disruption and vascular smooth muscle cell ...

Measuring Proliferation of Vascular Smooth Muscle Cells Using Click Chemistry

قياس انتشار خلايا العضلات الملساء الوعائية باستخدام الكيمياء فوق

The ability of a cell to proliferate is integral to the normal function of most cells, and dysregulation of proliferation is at the heart of many disease ...

Isolation of Primary Patient-specific Aortic Smooth Muscle Cells and Semiquantitative Real-time Contraction Measurements In Vitro

Isolation of Primary Patient-specific Aortic Smooth Muscle Cells and Semiquantitative Real-time Contraction Measurements In Vitro

عزل خلايا العضلات الملساء الأبهرية الأولية الخاصة بالمريض وقياسات الانقباض شبه الكمية في الوقت الفعلي في المختبر

Smooth muscle cells (SMCs) are the predominant cell type in the aortic media. Their contractile machinery is important for the transmission of force in ...