Name: generation of single-cell suspensions from mouse neural tissue
Uploaded: 2009-07-07T19:00:00
Duration: 11 min 17 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of Single-Cell Suspensions from Mouse Neural Tissue at JoVE.com

على العمل تحت ظروف معقمة ، فمن المستحسن لتنفيذ كافة الخطوات في تدفق الصفحي هود. 1. المواد <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الأنسجة العصبية التفكك كيت (P) (المكونات : الحل 1،2 و 3 و 4 ، والتخزين الاحتياطي) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قبل فصل فلاتر </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> (اختياري) الخرز إزالة المايلين </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بيتا المركابتويثانول </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> gentleMACS Dissociator </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> C أنابيب </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> MACSmix الأنبوب الدوار </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> HBSS (ث / س) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> HBSS (ث) </li></ul><ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد الحلول التالية قبل بداية البروتوكول : <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> هانكس &quot;محلول الملح التخزين المؤقت دون كاتيونات الكالسيوم ثنائي التكافؤ 2 + أو Mg 2 + (HBSS (ث / س) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> HBSS ، ومعيار ، أي مع الكالسيوم والمغنيسيوم 2 + 2 + (HBSS (ث) </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اعتمادا على حاتمة مستضد الفائدة في التطبيقات اللاحقة ، إما استخدام غراء المستندة إلى الأنسجة العصبية التفكك كيت (P) أو التربسين المستندة إلى الأنسجة العصبية التفكك كيت (T). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد الحلول التالية من أدوات الأنسجة العصبية التفكك : <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحل 2 : إضافة بيتا المركابتويثانول إلى 0.067 ملي </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحل 4 : مسحوق يذوب في 0.7 مل مخزن تخزين (المقدمة في المجموعة) ، ومزيج بلطف (لا الدوامة) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ميكس انزيم 1 : 1.9 مل من محلول الماصة 2 و 50 ميكرولتر الحل 1 (كلاهما من المجموعة) في أنبوب جيم واحتضان لمدة 10-15 دقيقة عند 37 درجة مئوية. هذه هي كافية لفصل 400 ملغ من أنسجة المخ. </li></ol></li></ol> 2. عدم الربط بين الأنسجة العصبية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تزن أنسجة المخ في أنبوب يحتوي على 1 مل HBSS (ث / س) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل مخ الفأر في أنبوب C تحتوي على 1950 ميكرولتر من أنزيم ميكس محمى 1. (ملاحظة : كتب هذا البروتوكول ل≤ 400 ملغ ، ولكن يمكن تحجيمها وحدات التخزين حل لتستوعب ما يصل إلى 1600 ملغ من نسيج المخ في الأنبوب C) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع أنبوب C على لDissociator gentleMACS وتشغيل برنامج &quot;m_brain_01&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان مع التناوب (4 دورة في الدقيقة باستخدام أنبوب MACSmix الدوار) لمدة 15 دقيقة عند 37 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع أنبوب C على لDissociator gentleMACS وتشغيل برنامج &quot;m_brain_02&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خلال الخطوة تعد تفارق 30 ميكرولتر من أنزيم ميكس 2 في 400 ملغ من النسيج من خلال مزج بلطف 20 ميكرولتر من محلول 3 و 10 ميكرولتر من الحل 4. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة أنزيم ميكس 2 إلى C أنبوب عبر الحاجز كاب مختومة والمزيج بلطف دون vortexing. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان الانبوب C مع التناوب لمدة 10 دقيقة عند 37 درجة مئوية في حاضنة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع أنبوب C على لDissociator gentleMACS وتشغيل برنامج &quot;m_brain_03&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان الانبوب C مع التناوب لمدة 10 دقيقة عند 37 درجة مئوية في حاضنة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أجهزة الطرد المركزي لفترة وجيزة لجمع عينة في الجزء السفلي من الأنبوب. </li></ol> 3. تصفية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اختيار مرشح كبيرة بما يكفي للسماح للمرور على خلايا الفائدة. على سبيل المثال ، خلايا بركينيي كبيرة جدا لتمر من خلال تصفية 30 ميكرون ، ولكن سوف Prominin - 1 + الخلايا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام ماصة suitable1000 ميكرولتر لإزالة الخلايا تشكل أنبوب C من خلال كاب الحاجز مختومة وتطبيقه على تصفية ما قبل الفصل في أنبوب جمع 15 مل. (ملاحظة : لأحجام أكبر عينة استخدام أنبوب جمع 50 مل). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل فلتر مع 10 مل من HBSS (ث). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الطرد المركزي الخلايا التي تمت تصفيتها في 300 x ج لمدة 10 دقيقة في RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend supernatent والمتوسطة في المخزن الخاص أو في الاختيار للتطبيقات اللاحقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لإزالة الحطام الميلين ، واستخدام الخرز إزالة الميالين. </li></ol> 4. ممثل النتيجة : يرجى الاطلاع على الأرقام 1-3 <img src="/files/ftp_upload/1267/Fig_1.png" alt="الشكل 1" /> الرقم. (1) أدى تفكك المخ مع Dissociator gentleMACS في خلايا قابلة للحياة بنسبة 97 ٪ ، كما يظهر تحليل تدفق cytometric. <img src="/files/ftp_upload/1267/1267fig2.png" alt="الشكل 2" /> الرقم. 2 صورة المجهر ضوء تشكيل خلية neurosphere بعد فرز المغناطيسي استخدام الألغام المضادة للProminin MicroBeads - 1 بعد 7 أيام من زراعتها في MACS ® NeuroMedium تستكمل مع PLUS MACS B27 الملحق. وأعدت خلايا من مخ الفأر CD1 (P3) باستخدام الأنسجة العصبية التفكك كيت (P). <img src="/files/ftp_upload/1267/1267fig4.jpg" alt="الشكل 3.5" /> الرقم. 3 المايلين في الحطام وحيدة الخلية تعليق يضعف إلى حد كبير بمعزل عن الخلية ، وإزالة الأنقاض التي الخرز إزالة النخاعين المايلين الزيادات فصل الخلايا الكفاءة. لفصل MACS استخدام الألغام المضادة للProminin MicroBeads - 1 ، وكان P22 مخ الفأر فصلها باستخدام الأنسجة العصبية التفكك كيت (P). وكانت الخلايا من التعليق وحيدة الخلية تستخدم إما مباشرة للانفصال ، أو قدمت إلى استنفاد المايلين باستخدام الخرز إزالة الميالين. مقارنة عينات من دون الانفصال عن ومع إزالة النخاعين ، يدل على أن نقاء أعلى للعينات مع إزالة النخاعين السابقة.

<ol>
	<li>Hardt, O., Scholz, C., K&#252;sters, D., Yanagawa, Y., Pennartz, S., Cremer, H., Bosio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+analysis+defines+differences+between+region-specific+GABAergic+neurons.">Gene expression analysis defines differences between region-specific GABAergic neurons.</a> Mol Cell Neurosci. 39, 418-428 (2008).</li><li>Lee, J. K., McCoy, M. K., Harms, A. S., Ruhn, K. A., Gold, S. J., Tansey, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulator+of+G-protein+signaling+10+promotes+dopaminergic+neuron+survival+via+regulation+of+the+microglial+inflammatory+response.">Regulator of G-protein signaling 10 promotes dopaminergic neuron survival via regulation of the microglial inflammatory response.</a> J Neurosci. 28, 8517-8528 (2008).</li><li>K&#246;rnyei, Z., G&#243;cza, E., R&#252;hl, R., Orsolits, B., V&#246;r&#246;s, E., Szab&#243;, B., V&#225;govits, B., Madar&#225;sz, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astroglia-derived+retinoic+acid+is+a+key+factor+in+glia-induced+neurogenesis.">Astroglia-derived retinoic acid is a key factor in glia-induced neurogenesis.</a> FASEB J. 21, 2496-2509 (2007).</li><li>Meylan, F., Davidson, T. S., Kahle, E., Kinder, M., Acharya, K., Jankovic, D., Bundoc, V., Hodges, M., Shevach, E. M., Keane-Myers, A., Wang, E. C., Siegel, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+TNF-family+receptor+DR3+is+essential+for+diverse+T+cell-mediated+inflammatory+diseases.">The TNF-family receptor DR3 is essential for diverse T cell-mediated inflammatory diseases.</a> Immunity. 29, 79-89 (2008).</li><li>Skog, J., W&#252;rdinger, T., van Rijn, S., Meijer, D. H., Gainche, L., Sena-Esteves, M., Curry, W. T., Carter, B. S., Krichevsky, A. M., Breakefield, X. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glioblastoma+microvesicles+transport+RNA+and+proteins+that+promote+tumour+growth+and+provide+diagnostic+biomarkers.">Glioblastoma microvesicles transport RNA and proteins that promote tumour growth and provide diagnostic biomarkers.</a> Nat Cell Biol. 10, 1470-1476 (2008).</li></ol>

الكتاب هم من موظفي شركة محدودة Miltenyi بيوتيك ، ألمانيا.

وDissociator gentleMACS يسهل إعداد موحدة وحيدة الخلية تعليق من الأنسجة العصبية في نظام مغلق. الأنسجة العصبية هي الأمثل للحفاظ على أطقم التفكك الحواتم المستضد اللازمة لتطبيقات أخرى مثل وimmunostainings immunomagnetic فصل الخلية 1-5. في هذا البروتوكول نظهر التفكك طيف الأنزيمية للدماغ فأر باستخدام Dissociator gentleMACS والأنسجة العصبية التفكك كيت (P) ، مما أسفر في خلايا قابلة للحياة 97 ٪. 100 ملغ من غلة الأنسجة العصبية بين 6 و 5x10 1x10 7 خلايا ، اعتمادا على عمر النسيج المضيف. وقد تم عزل المستهدفة Prominin - 1 + الخلايا باستخدام مضاد للProminin - 1 MicroBeads واقتيد بعد ذلك إلى الثقافة. يظهر بروتوكول لتكون أكثر فعالية مع استخدام إضافية من الخرز إزالة المايلين عند العمل مع الأنسجة العصبية المشتقة من P7&gt; الفئران.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>C Tubes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Miltenyi Biotec</td>
<td>Order no. 130-093-237</td>
<td><a href="http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_709_763_gentleMACS_Dissociator.aspx">http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_709_763_gentleMACS_Dissociator.aspx</a></td>
</tr>
<tr>
<td>gentleMACS&#x2122; Starting Kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Miltenyi Biotec</td>
<td>Order no. 130-093-235</td>
<td><a href="http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_709_763_gentleMACS_Dissociator.aspx">http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_709_763_gentleMACS_Dissociator.aspx</a></td>
</tr>
<tr>
<td>MACSmix&#x2122; Tube Rotator</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Miltenyi Biotec</td>
<td>Order no. 130-090-753</td>
<td><a href="http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_34_251_MACSmix_Tube_Rotator.aspx">http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_34_251_MACSmix_Tube_Rotator.aspx</a></td>
</tr>
<tr>
<td>Neural Tissue Dissociation Kit (P)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Miltenyi Biotec</td>
<td>Order no. 130-092-628</td>
<td><a href="http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_712_656_Neural_Tissue_Dissociation_Kits.aspx">http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_712_656_Neural_Tissue_Dissociation_Kits.aspx</a></td>
</tr>
<tr>
<td>Pre-Separation Filters</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Miltenyi Biotec</td>
<td>Order no. 130-041-407</td>
<td><a href="http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_34_247_Pre_Separation_Filters.aspx">http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_34_247_Pre_Separation_Filters.aspx</a></td>
</tr>
<tr>
<td>Anti-Prominin-1 MicroBeads</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Miltenyi Biotec</td>
<td>Order no. 130-092-333</td>
<td><a href="http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_654_524_Anti_Prominin_1_MicroBeads.aspx">http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_654_524_Anti_Prominin_1_MicroBeads.aspx</a></td>
</tr>
<tr>
<td>Anti-Prominin-1-APC</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Miltenyi Biotec</td>
<td>Order no. 130-092-335</td>
<td><a href="http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_599_525_Anti_Prominin_1.aspx">http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_599_525_Anti_Prominin_1.aspx</a></td>
</tr>
<tr>
<td>Myelin Removal Beads</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Miltenyi Biotec</td>
<td>Order no. 130-094-544</td>
<td><a href="http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_712_688_Myelin_Removal_Beads.aspx">http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_712_688_Myelin_Removal_Beads.aspx</a></td>
</tr>
<tr>
<td>Art 1000 Reach Pipet Tips </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Molecular BioProducts</td>
<td>Order no. 2079</td>
<td><a href="http://www.mbpinc.com/ASP/products.aspx?query_TipID=61">http://www.mbpinc.com/ASP/products.aspx?query_TipID=61</a> 
<a href="http://www.mbpinc.com/html/products/art/display.html">http://www.mbpinc.com/html/products/art/display.html</a></td>
</tr>
<tr>
<td>Neural Tissue Dissociation Kit (T)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Miltenyi Biotec</td>
<td>Order no. 130-093-231</td>
<td><a href="http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_712_656_Neural_Tissue_Dissociation_Kits.aspx">http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_712_656_Neural_Tissue_Dissociation_Kits.aspx</a></td>
</tr>
<tr>
<td>Propidium Iodide Solution</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Miltenyi Biotec</td>
<td>Order no. 130-093-233</td>
<td><a href="http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_337_744_Propidium_Iodide_Solution.aspx">http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_337_744_Propidium_Iodide_Solution.aspx</a></td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

generation of single-cell suspensions from mouse neural tissue

داخل الجهاز العصبي ، وقد وصفت المئات من أنواع الخلايا العصبية والدبقية. لكل نوع من أنواع معينة من الخلايا في الدماغ أو النخاع الشوكي لديه ذخيرة من جزيئات سطح الخلية ، أو المحددات الجزيئية ، والتي يمكن من خلالها التعرف عليه ، وتميزت. حاليا ، تحديد الخلية قوية وتقنيات الفصل يتطلب أن تكون ولدت وحيدة الخلية مع الحد في الوقت نفسه الاستعدادات موت الخلايا وتدمير للبروتين سطح مميزة. يمكن للDissociator gentleMACS ، عندما تستخدم في تركيبة مع التربسين أو غراء المستندة مجموعات تفارق وفعالية وبلطف فصل أنسجة المخ مع الحفاظ الحواتم المستضد ، والحد من فقدان الخلية. ويتحقق إعداد موحدة وحيدة الخلية الايقاف باستخدام أنابيب C ، وتحسين برامج gentleMACS مسبقا. ويمكن علاج تولد مرة واحدة ، وحيدة الخلية وحيدة النسيلة تقارن مع تعليق مثل مكافحة Prominin 1 - MicroBeads ، التي تحدد الأسلاف العصبية ، أو تنقيتها باستخدام مزيد من الخرز إزالة الميالين.

Watch this Scientific Journal Video about Generation of Single-Cell Suspensions from Mouse Neural Tissue at JoVE.com

Generation of Single-Cell Suspensions from Mouse Neural Tissue

الفصل بين أنواع خلايا من نسيج معين يتطلب المعلمات محددة لaggitation الأنسجة للحصول على كميات كبيرة من الخلايا ، قابلة للحياة زروع. وgentleMACS Miltenyi Dissociator يحسن هذه المهمة مع بروتوكول بسيطة وعملية. في هذا الكتاب هو شرح لاستخدام هذا الجهاز على أنسجة nerual.

جيل وحيدة الخلية معلقات من الأنسجة العصبية ماوس

Within the nervous system, hundreds of neuronal and glial cell types have been described. Each specific cell type in the brain or spinal cord has a ...

Research

JoVE Journal

Biology

Preparation of Single-Cell Suspensions from Mouse Spleen with the gentleMACS Dissociator

إعداد وحيدة الخلية معلقات من الطحال ماوس مع Dissociator gentleMACS

Single-cell suspensions are a prerequisite for experiments in cell separation, cell analysis and cell culture.  To avoid tedious and often painful manual ...

Standardized Preparation of Single-Cell Suspensions from Mouse Lung Tissue using the gentleMACS Dissociator

إعداد موحدة وحيدة الخلية معلقات من أنسجة الرئة باستخدام الماوس Dissociator gentleMACS

The preparation of single-cell suspensions from tissues is an important prerequisite for many experiments in cellular research. The process of ...

Obtaining High Quality RNA from Single Cell Populations in Human Postmortem Brain Tissue

الحصول على جودة عالية من الحمض النووي الريبي بالسكان خلية واحدة في الإنسان تشريح أنسجة المخ

We proposed to investigate the gray matter reduction in the superior temporal gyrus seen in schizophrenia patients, by interrogating gene expression ...

Single-cell Suction Recordings from Mouse Cone Photoreceptors

تسجيلات شفط وحيدة الخلية المستقبلة من المخروط ماوس

Rod and cone photoreceptors in the retina are responsible for light detection. In darkness, cyclic nucleotide-gated (CNG) channels in the outer segment ...

Single Cell Transcriptional Profiling of Adult Mouse Cardiomyocytes

التنميط واحدة من الخلايا العضلية الترانسكربتي ماوس الكبار

While numerous studies have examined gene expression changes from homogenates of heart tissue, this prevents studying the inherent stochastic variation ...

Generation of Mice Derived from Induced Pluripotent Stem Cells

جيل من الفئران المستمدة من الخلايا الجذعية المحفزة المستحثة

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also ...

Generation of Human Kidney Tubuloids from Tissue and Urine

جيل من توبولويدات الكلى البشرية من الأنسجة والبول

Adult stem cell (ASC)-derived human kidney epithelial organoids, or tubuloids, can be established from healthy and diseased kidney epithelium with high ...

Isolation of Endothelial Cells from the Lumen of Mouse Carotid Arteries for Single-Cell Multi-Omics Experiments

عزل الخلايا البطانية عن تجويف الشرايين السباتية للفئران لإجراء تجارب متعددة الخلايا أحادية الخلية

Atherosclerosis is an inflammatory disease of the arterial regions exposed to disturbed blood flow (d-flow). D-flow regulates the expression of genes in ...

Isolation of Nuclei from Flash-Frozen Liver Tissue for Single-Cell Multiomics

عزل النوى من أنسجة الكبد المجمدة بالفلاش من أجل Multiomics أحادية الخلية

The liver is a complex and heterogenous tissue responsible for carrying out many critical physiological functions, such as the maintenance of energy ...

Single-Cell Suspension Preparation from Nile Tilapia Intestine for Single-Cell Sequencing

تحضير معلق أحادي الخلية من أمعاء البلطي النيلي لتسلسل الخلية الواحدة

Nile tilapia is one of the most commonly cultured freshwater fish species worldwide and is a widely used research model for aquaculture fish studies. The ...