Name: generation of single-cell suspensions from mouse neural tissue
Uploaded: 2009-07-07T19:00:00
Duration: 11 min 17 s
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Um Arbeit unter sterilen Bedingungen, ist es empfehlenswert, alle Schritte in einer Sterilbank durchgeführt. 1. Materialien <ul><li> Neural Gewebedissoziation Kit (P) (Komponenten: Lösung 1,2, 3 und 4, Storage Buffer) </li><li> Pre-Separation-Filter </li><li> (Optional) Myelin Removal Beads </li><li> Beta-Mercaptoethanol </li><li> gentleMACS Dissociator </li><li> C Tubes </li><li> MACSmix Tube Rotator </li><li> HBSS (w / o) </li><li> HBSS (w) </li></ul><ol><li> Stellen Sie folgende Lösungen vor Beginn des Protokolls: <ol><li> Hanks &#39;Salzlösung ohne zweiwertige Kationen Ca 2 + oder Mg 2 + (HBSS (w / o) </li><li> HBSS, Standard, dh mit Ca 2 + und Mg 2 + (HBSS (w) </li></ol></li><li> Abhängig von der Antigen-Epitop von Interesse in den folgenden Anwendungen verwenden entweder die Papain-basierte Neural Gewebedissoziation Kit (P) oder Trypsin-basierte Neural Gewebedissoziation Kit (T). </li><li> Bereiten Sie die folgenden Lösungen aus dem Nervengewebe Dissoziation Kit: <ol><li> Lösung 2: add beta-Mercaptoethanol bis 0,067 mM </li><li> Lösung 4: Das Pulver in 0,7 ml Lagerpuffer (sofern im Kit enthalten), vorsichtig mischen (nicht vortexen) </li><li> Enzyme Mix 1: Pipette 1,9 ml Lösung 2 und 50 ul Lösung 1 (beide aus Kit) in eine C Tube und Inkubation für 10-15 min bei 37 ° C. Das genügt, um 400 mg des Gehirngewebes zu distanzieren. </li></ol></li></ol> 2. Dissoziation der Nervengewebe <ol><li> Wiegen Hirngewebe in ein Röhrchen mit 1 ml HBSS (w / o) </li><li> Transfer-Maus Gehirn in der C Rohr mit 1950 ul vorgewärmtes Enzyme Mix 1. (Hinweis: Dieses Protokoll ist für ≤ 400 mg geschrieben, aber Lösung Volumes können skaliert auf bis zu 1600 mg Hirngewebe pro C Rohr sein) </li><li> Legen Sie die C Tube auf die gentleMACS Dissociator und Run-Programm &quot;m_brain_01&quot;. </li><li> Inkubieren mit Rotation (4 min mit einem MACSmix Tube Rotator) für 15 min bei 37 ° C. </li><li> Legen Sie die C Tube auf die gentleMACS Dissociator und Run-Programm &quot;m_brain_02&quot;. </li><li> Während der Dissoziation Schritt vorzubereiten 30 ul Enzym Mix 2 pro 400 mg Gewebe durch vorsichtiges Mischen von 20 ul der Lösung 3 und 10 ul Lösung 4. </li><li> Add Enzyme Mix 2 der C Rohr über das Septum-Dichtkappe und vorsichtig mischen, ohne Verwirbelungen. </li><li> Inkubieren Sie die C Tube mit Rotation für 10 min bei 37 ° C im Brutschrank. </li><li> Legen Sie die C Tube auf die gentleMACS Dissociator und Run-Programm &quot;m_brain_03&quot;. </li><li> Inkubieren Sie die C Tube mit Rotation für 10 min bei 37 ° C im Brutschrank. </li><li> Kurz zentrifugieren, um die Probe am Boden des Röhrchens zu sammeln. </li></ol> 3. Filtration <ol><li> Wählen Sie einen Filter groß genug, um den Durchgang zu den Zellen von Interesse erlauben. Zum Beispiel sind Purkinjezellen zu groß, um durch eine 30 pm Filter passieren, aber Prominin-1 + Zellen. </li><li> Verwenden Sie einen suitable1000 ul Pipette auf die Zellen zu entfernen bilden die C Rohr durch das Septum verschlossenen Deckel und es auf die Pre-Separation-Filter auf einem 15 ml-Collection-Tube. (Hinweis: Bei größeren Stichproben mit einem 50 ml-Collection-Tube). </li><li> Waschen Sie den Filter mit 10 ml HBSS (w). </li><li> Centrifuge die gefilterten Zellen bei 300 xg für 10 min bei RT. </li><li> Resuspendieren der Überstand in Ihrem Medium oder Puffer der Wahl für spätere Anwendungen. </li><li> So entfernen Sie Myelin Trümmer, verwenden Myelin Removal Perlen. </li></ol> 4. Repräsentatives Ergebnis: siehe Abbildungen 1-3 <img src="/files/ftp_upload/1267/Fig_1.png" alt="Abb. 1" /> Abbildung. 1 Das Gehirn Dissoziation mit der gentleMACS Dissociator führte in 97% lebensfähige Zellen, wie die durchflusszytometrische Analyse zeigt. <img src="/files/ftp_upload/1267/1267fig2.png" alt="Abb. 2" /> Abbildung. 2 Light-Aufnahme von Neurosphäre Bildung nach magnetischer Zellsortierung mit Anti-Prominin-1 MicroBeads nach 7 Tagen Kultivierung in MACS ® NeuroMedium mit MACS Supplement B27 PLUS ergänzt. Die Zellen wurden aus CD1 Gehirn der Maus (P3) mit dem Neural Gewebedissoziation Kit (P) vorbereitet. <img src="/files/ftp_upload/1267/1267fig4.jpg" alt="Abb. 3.5" /> Abbildung. 3 Myelin Trümmer in Einzel-Zellsuspensionen erheblich beeinträchtigt Zellisolation und das Entfernen von Myelin Trümmer von Myelin Removal Perlen steigert die Effizienz Zelle Trennungen. Für MACS Separations mit Anti-Prominin-1 MicroBeads wurde P22 Maushirn dissoziiert mit dem Neural Gewebedissoziation Kit (P). Zellen aus der Einzel-Zell-Suspension wurden entweder direkt für die Trennung verwendet werden, oder wurden eingereicht, um einer Verarmung Myelin mit Myelin Removal Perlen. Vergleicht man die Trennung von Proben ohne und mit Myelin Entfernung, zeigt, dass die Reinheit höher ist für Proben mit früheren Myelin Entfernung.

<ol>
	<li>Hardt, O., Scholz, C., K&#252;sters, D., Yanagawa, Y., Pennartz, S., Cremer, H., Bosio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+analysis+defines+differences+between+region-specific+GABAergic+neurons.">Gene expression analysis defines differences between region-specific GABAergic neurons.</a> Mol Cell Neurosci. 39, 418-428 (2008).</li><li>Lee, J. K., McCoy, M. K., Harms, A. S., Ruhn, K. A., Gold, S. J., Tansey, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulator+of+G-protein+signaling+10+promotes+dopaminergic+neuron+survival+via+regulation+of+the+microglial+inflammatory+response.">Regulator of G-protein signaling 10 promotes dopaminergic neuron survival via regulation of the microglial inflammatory response.</a> J Neurosci. 28, 8517-8528 (2008).</li><li>K&#246;rnyei, Z., G&#243;cza, E., R&#252;hl, R., Orsolits, B., V&#246;r&#246;s, E., Szab&#243;, B., V&#225;govits, B., Madar&#225;sz, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astroglia-derived+retinoic+acid+is+a+key+factor+in+glia-induced+neurogenesis.">Astroglia-derived retinoic acid is a key factor in glia-induced neurogenesis.</a> FASEB J. 21, 2496-2509 (2007).</li><li>Meylan, F., Davidson, T. S., Kahle, E., Kinder, M., Acharya, K., Jankovic, D., Bundoc, V., Hodges, M., Shevach, E. M., Keane-Myers, A., Wang, E. C., Siegel, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+TNF-family+receptor+DR3+is+essential+for+diverse+T+cell-mediated+inflammatory+diseases.">The TNF-family receptor DR3 is essential for diverse T cell-mediated inflammatory diseases.</a> Immunity. 29, 79-89 (2008).</li><li>Skog, J., W&#252;rdinger, T., van Rijn, S., Meijer, D. H., Gainche, L., Sena-Esteves, M., Curry, W. T., Carter, B. S., Krichevsky, A. M., Breakefield, X. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glioblastoma+microvesicles+transport+RNA+and+proteins+that+promote+tumour+growth+and+provide+diagnostic+biomarkers.">Glioblastoma microvesicles transport RNA and proteins that promote tumour growth and provide diagnostic biomarkers.</a> Nat Cell Biol. 10, 1470-1476 (2008).</li></ol>

Die Autoren sind Mitarbeiter von Miltenyi Biotec GmbH, Deutschland.

Die gentleMACS Dissociator erleichtert die standardisierte Erstellung von Einzel-Zellsuspensionen von Nervengewebe in einem geschlossenen System. Neural Gewebedissoziation Kits sind optimiert, um Antigen-Epitope für weitere Anwendungen wie Immunofärbungen und immunomagnetische Zellseparation 1-5 benötigt bewahren. In diesem Protokoll zeigen wir die schonende enzymatische Spaltung von Gehirn der Maus mit dem gentleMACS Dissociator und der Neural Gewebedissoziation Kit (P), was in 97% lebensfähige Zellen. 100 mg Nervengewebe Ausbeuten zwischen 5x10 6 und 1x10 7 Zellen, je nach dem Alter der Wirtsgewebe. Die gezielte Prominin-1 + Zellen wurden isoliert mit Anti-Prominin-1 MicroBeads und anschließend in Kultur genommen. Das Protokoll wird gezeigt werden, noch effektiver mit den zusätzlichen Einsatz von Myelin Removal Beads bei der Arbeit mit neuronalen Gewebe von Mäusen&gt; P7 abgeleitet.

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		<div>
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		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>C Tubes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Miltenyi Biotec</td>
<td>Order no. 130-093-237</td>
<td><a href="http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_709_763_gentleMACS_Dissociator.aspx">http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_709_763_gentleMACS_Dissociator.aspx</a></td>
</tr>
<tr>
<td>gentleMACS&#x2122; Starting Kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Miltenyi Biotec</td>
<td>Order no. 130-093-235</td>
<td><a href="http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_709_763_gentleMACS_Dissociator.aspx">http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_709_763_gentleMACS_Dissociator.aspx</a></td>
</tr>
<tr>
<td>MACSmix&#x2122; Tube Rotator</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Miltenyi Biotec</td>
<td>Order no. 130-090-753</td>
<td><a href="http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_34_251_MACSmix_Tube_Rotator.aspx">http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_34_251_MACSmix_Tube_Rotator.aspx</a></td>
</tr>
<tr>
<td>Neural Tissue Dissociation Kit (P)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Miltenyi Biotec</td>
<td>Order no. 130-092-628</td>
<td><a href="http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_712_656_Neural_Tissue_Dissociation_Kits.aspx">http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_712_656_Neural_Tissue_Dissociation_Kits.aspx</a></td>
</tr>
<tr>
<td>Pre-Separation Filters</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Miltenyi Biotec</td>
<td>Order no. 130-041-407</td>
<td><a href="http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_34_247_Pre_Separation_Filters.aspx">http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_34_247_Pre_Separation_Filters.aspx</a></td>
</tr>
<tr>
<td>Anti-Prominin-1 MicroBeads</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Miltenyi Biotec</td>
<td>Order no. 130-092-333</td>
<td><a href="http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_654_524_Anti_Prominin_1_MicroBeads.aspx">http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_654_524_Anti_Prominin_1_MicroBeads.aspx</a></td>
</tr>
<tr>
<td>Anti-Prominin-1-APC</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Miltenyi Biotec</td>
<td>Order no. 130-092-335</td>
<td><a href="http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_599_525_Anti_Prominin_1.aspx">http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_599_525_Anti_Prominin_1.aspx</a></td>
</tr>
<tr>
<td>Myelin Removal Beads</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Miltenyi Biotec</td>
<td>Order no. 130-094-544</td>
<td><a href="http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_712_688_Myelin_Removal_Beads.aspx">http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_712_688_Myelin_Removal_Beads.aspx</a></td>
</tr>
<tr>
<td>Art 1000 Reach Pipet Tips </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Molecular BioProducts</td>
<td>Order no. 2079</td>
<td><a href="http://www.mbpinc.com/ASP/products.aspx?query_TipID=61">http://www.mbpinc.com/ASP/products.aspx?query_TipID=61</a> 
<a href="http://www.mbpinc.com/html/products/art/display.html">http://www.mbpinc.com/html/products/art/display.html</a></td>
</tr>
<tr>
<td>Neural Tissue Dissociation Kit (T)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Miltenyi Biotec</td>
<td>Order no. 130-093-231</td>
<td><a href="http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_712_656_Neural_Tissue_Dissociation_Kits.aspx">http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_712_656_Neural_Tissue_Dissociation_Kits.aspx</a></td>
</tr>
<tr>
<td>Propidium Iodide Solution</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Miltenyi Biotec</td>
<td>Order no. 130-093-233</td>
<td><a href="http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_337_744_Propidium_Iodide_Solution.aspx">http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_337_744_Propidium_Iodide_Solution.aspx</a></td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

generation of single-cell suspensions from mouse neural tissue

Innerhalb des Nervensystems, haben Hunderte von neuronalen und glialen Zelltypen beschrieben worden. Jeder Zelltyp im Gehirn oder Rückenmark hat ein Repertoire von Zelloberflächen-Moleküle oder molekulare Determinanten, durch die sie identifiziert und charakterisiert werden können. Derzeit erfordern robuste Zelle Identifikation und Trenntechnik Single-Cell-Präparate zu erzeugen und gleichzeitig die Begrenzung Zelltod und die Zerstörung der charakteristischen Oberfläche Protein sein. Die gentleMACS Dissociator, wenn es in Kombination mit Trypsin oder Papain-basierte Dissoziation Kits verwendet wird, kann effektiv und schonend distanzieren Hirngewebe unter Beibehaltung Antigen-Epitope und die Begrenzung der Zellverlust. Standardisierte Erstellung von Einzel-Zell-Suspensionen erfolgt über C Rohre und optimiert, Preset gentleMACS Programme. Einmal erzeugt, Einzel-Zellsuspensionen mit monoklonalen Konjugate wie Anti-Prominin-1 MicroBeads, die neuralen Vorläuferzellen zu identifizieren, oder weiter gereinigt mit Myelin Removal Beads behandelt werden.

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Generation of Single-Cell Suspensions from Mouse Neural Tissue

Distanziert Zellen aus bestimmten Gewebearten erfordert spezifische Parameter für Gewebe aggitation zu einem hohen Volumen von lebensfähigen, kultivierbaren Zellen zu erhalten. Die Miltenyi gentleMACS Dissociator optimiert diese Aufgabe mit einem einfachen, praktischen Protokoll. In dieser Veröffentlichung wird die Verwendung dieser Vorrichtung auf nerual Gewebe erklärt.

Generierung von Einzel-Zellsuspensionen aus Maus Nervengewebe

Within the nervous system, hundreds of neuronal and glial cell types have been described. Each specific cell type in the brain or spinal cord has a ...

Research

JoVE Journal

Biology

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Erstellung von Einzel-Zellsuspensionen aus Maus-Milz mit dem gentleMACS Dissociator

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Forschung

Biologie

Standardized Preparation of Single-Cell Suspensions from Mouse Lung Tissue using the gentleMACS Dissociator

Standardisierte Erstellung von Einzel-Zellsuspensionen aus Maus Lungengewebe mit dem gentleMACS Dissociator

The preparation of single-cell suspensions from tissues is an important prerequisite for many experiments in cellular research. The process of ...

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