Name: virus-induced gene silencing (vigs) in nicotiana benthamiana and tomato
Uploaded: 2009-06-10T00:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Virus-induced Gene Silencing VIGS in Nicotiana benthamiana and Tomato at JoVE.com

Wij danken dr. Patricia Manosalva voor haar waardevolle inzichten op het manuscript. De financiering werd verstrekt door de National Science Foundation Plant Genome Program, award aantal DBI-0605059.

Deel 1: Plant-materiaal N. benthamiana planten die voor silencing moet ongeveer 2 ½ week oud is het tijdstip waarop de zaadlobben en de eerste 2 - 4 Juist bladeren ontstaan. Tomaat (Solanum lycopersicum) planten worden gebruikt 7 - 8 dagen na opkomst, wanneer de ware bladeren nog niet verschenen. Deel 2: VIGS DAG 1 <ol><li> Voor elk experiment, zijn Agrobacterium tumefaciens koesteren pTRV1, pTRV2, pTRV2-P...

<ol>
	<li>Voinnet, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+silencing+as+a+plant+immune+system+against+viruses.">RNA silencing as a plant immune system against viruses.</a> Trends Genet. 17, 449-459 (2001).</li><li>Carrington, J. C., Ambros, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+microRNAs+in+plant+and+animal+development.">Role of microRNAs in plant and animal development.</a> Science. 301, 336-338 (2003).</li><li>Chen, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microRNA+as+a+translational+repressor+of+APETALA2+in+Arabidopsis+flower+development.">A microRNA as a translational repressor of APETALA2 in Arabidopsis flower development.</a> Science. 303, 2022-2025 (2004).</li><li>Palatnik, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+leaf+morphogenesis+by+microRNAs.">Control of leaf morphogenesis by microRNAs.</a> Nature. 425, 257-263 (2003).</li><li>Brigneti, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+pathogenicity+determinants+are+suppressors+of+transgene+silencing+in+Nicotiana+benthamiana.">Viral pathogenicity determinants are suppressors of transgene silencing in Nicotiana benthamiana.</a> EMBO J. 17, 6739-6746 (1998).</li><li>Liu, Y., Schiff, M., Dinesh-Kumar, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Virus-induced+gene+silencing+in+tomato.">Virus-induced gene silencing in tomato.</a> Plant Journal. 31, 777-786 (2002).</li><li>MacFarlane, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+biology+of+the+tobraviruses.">Molecular biology of the tobraviruses.</a> J. Gen. Virol. 80, 2799-2807 (1999).</li><li>Senthil-Kumar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+systematic+study+to+determine+the+extent+of+gene+silencing+in+Nicotiana+benthamiana+and+other+Solanaceae+species+when+heterologous+gene+sequences+are+used+for+virus-induced+gene+silencing.">A systematic study to determine the extent of gene silencing in Nicotiana benthamiana and other Solanaceae species when heterologous gene sequences are used for virus-induced gene silencing.</a> New Phytol. 176, 782-791 (2007).</li><li>McCullen, C. A., Binns, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agrobacterium+tumefaciens+and+plant+cell+interactions+and+activities+required+for+interkingdom+macromolecular+transfer.">Agrobacterium tumefaciens and plant cell interactions and activities required for interkingdom macromolecular transfer.</a> Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 22, 101-127 (2006).</li><li>Rosebrock, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+bacterial+E3+ubiquitin+ligase+targets+a+host+protein+kinase+to+disrupt+plant+immunity.">A bacterial E3 ubiquitin ligase targets a host protein kinase to disrupt plant immunity.</a> Nature. 448, 370-374 (2007).</li><li>Miki, D., Itoh, R., Shimamoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+silencing+of+single+and+multiple+members+in+a+gene+family+of+rice.">RNA silencing of single and multiple members in a gene family of rice.</a> Plant Physiol. 138, 1903-1913 (2005).</li><li>Voinnet, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use,+tolerance+and+avoidance+of+amplified+RNA+silencing+by+plants.">Use, tolerance and avoidance of amplified RNA silencing by plants.</a> Trends Plant Sci. 13, 317-328 (2008).</li><li>Ekengren, S. K., Liu, Y., Schiff, M., Kumar-Dinesh, S. P., Martin, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+MAPK+cascades,+NPR1,+and+TGA+transcription+factors+play+a+role+in+Pto-mediated+disease+resistance+in+tomato.">Two MAPK cascades, NPR1, and TGA transcription factors play a role in Pto-mediated disease resistance in tomato.</a> Plant J. 36, 905-917 (2003).</li><li>Liu, E., Page, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+cDNA+libraries+for+virus-induced+gene+silencing+(VIGS)+using+tobacco+rattle+virus.">Optimized cDNA libraries for virus-induced gene silencing (VIGS) using tobacco rattle virus.</a> Plant. Methods. 4, 5-5 (2008).</li></ol>

Virus-geïnduceerde gene silencing is een methode die snel omgekeerde genetische screens mogelijk maakt. Het vermijdt de generatie van T-DNA of transposon gemedieerde gen knock-outs, die alleen beschikbaar zijn in bepaalde planten zoals Arabidopsis en maïs. Het omzeilt ook de tijdrovende proces van plant transformatie en maakt de gerichtheid van meerdere genen op hetzelfde moment, op voorwaarde dat ze voldoende homologie 10 of dat andere host doelsequenties zijn gerangschikt in tandem in het zwijgen...

virus-induced gene silencing (vigs) in nicotiana benthamiana and tomato

RNA-interferentie (RNAi) is een zeer specifiek gen-silencing fenomeen veroorzaakt door een dsRNA. Dit zwijgen op te leggen mechanisme maakt gebruik van twee grote klassen van RNA toezichthouders: microRNA&#39;s, die geproduceerd worden uit niet-eiwit-coderende genen en short interfering RNA&#39;s (siRNA&#39;s). Planten gebruiken RNAi om transposons controle en strakke controle over ontwikkelingsprocessen zoals bloem orgel vorming en de bladontwikkeling 2,3,4 uit te oefenen. Planten ook gebruik maken van RNAi om zichzelf te verdedigen tegen infecties door virussen. Bijgevolg hebben veel virussen geëvolueerd onderdrukkers van gene silencing om hun succesvolle kolonisatie van hun gastheer 5 mogelijk te maken. Virus-geïnduceerde gen silencing (VIGS) is een methode die gebruik maakt van de plant RNAi-gemedieerde antiviraal verdedigingsmechanisme. Bij planten die besmet zijn met niet-gemodificeerde virussen het mechanisme is specifiek gericht tegen het virale genoom. Echter, met virus vectoren die sequenties afgeleid van gastheer genen, kan het proces bovendien gericht tegen de corresponderende gastheer mRNA&#39;s. VIGS is aangepast voor high-throughput functionele genomica in planten met behulp van de plant pathogeen Agrobacterium tumefaciens te leveren, via de Ti-plasmide, een recombinant virus dragen van de gehele of een deel van de gensequentie gericht op zwijgen. Systemische verspreiding van het virus en de endogene plant RNAi machines zorgen voor de rest. dsRNA&#39;s die overeenkomen met de target-gen worden geproduceerd en vervolgens gesplitst door de ribonuclease Dicer in siRNA&#39;s van 21 tot 24 nucleotiden in lengte. Deze siRNA&#39;s uiteindelijk leiden de RNA-silencing geïnduceerde complex (RISC) om het doel transcript twee degraderen. Verschillende vectoren zijn tewerkgesteld in VIGS en een van de meest gebruikte is gebaseerd op tabak rammelaar virus (TRV). TRV is een tweedelig virus en als zodanig, twee verschillende A. tumefaciens stammen worden gebruikt voor VIGS. Een draagt ​​pTRV1, die de replicatie en beweging virale functies codeert, terwijl de andere, pTRV2, havens de vacht eiwit en de sequentie die wordt gebruikt voor de VIGS 6,7. Inoculatie van Nicotiana benthamiana en tomaat zaailingen met een mengsel van beide stammen resulteert in een gen-silencing. Monddood maken van de endogene phytoene desaturase (PDS)-gen, waardoor fotobleken, wordt gebruikt als een controle voor VIGS efficiency. Hierbij moet echter worden opgemerkt, dat de silencing in tomaat is meestal minder efficiënt dan in N. benthamiana. RNA transcript overvloed van het gen van belang moet altijd worden gemeten om ervoor te zorgen dat de doelstelling-gen efficiënt is down-gereguleerd. Toch heterologe gen-sequenties uit N. benthamiana kan worden gebruikt om hun respectievelijke orthologen stilte in tomaat en vice versa 8.

Watch this Scientific Journal Video about Virus-induced Gene Silencing VIGS in Nicotiana benthamiana and Tomato at JoVE.com

Virus-induced Gene Silencing VIGS in Nicotiana benthamiana and Tomato

Beschrijving van een virus-geïnduceerde gen silencing (VIGS) methode voor de knock-down van genexpressie in<em&gt; Nicotiana benthamiana</em&gt; En tomaat.

Virus-geïnduceerde gen silencing (VIGS) in Nicotiana benthamiana En Tomaat

RNA interference (RNAi) is a highly specific gene-silencing phenomenon triggered by dsRNA1. This silencing mechanism uses two major classes of RNA ...

Research

JoVE Journal

Biology

Virus-induced Gene Silencing (VIGS) in Nicotiana benthamiana and Tomato

Live Cell Calcium Imaging Combined with siRNA Mediated Gene Silencing Identifies Ca2+ Leak Channels in the ER Membrane and their Regulatory Mechanisms

Live Cell Calcium Imaging Combined with siRNA Mediated Gene Silencing Identifies Ca2+ Leak Channels in the ER Membrane and their Regulatory Mechanisms

Live-Cell Calcium Imaging Gecombineerd met siRNA gemedieerde gen-silencing Identificeert Ca 2 + Lek Kanalen in het ER membraan en de regulerende mechanismen

In mammalian cells, the endoplasmic reticulum (ER) plays a key role in protein biogenesis as well as in calcium signalling1. The heterotrimeric Sec61 ...

Induction and Testing of Hypoxia in Cell Culture

Inductie en testen van Hypoxie in celkweek

Hypoxia is defined as the reduction or lack of oxygen in organs, tissues, or cells.  This decrease of oxygen tension can be due to a reduced supply in ...

Agrobacterium-Mediated Virus-Induced Gene Silencing Assay In Cotton

Agrobacterium-gemedieerde virus-geïnduceerde gen silencing Assay In Cotton

Cotton (Gossypium hirsutum) is one of the most important crops worldwide. Considerable efforts have been made on molecular breeding of new varieties.  The ...

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

Isolatie van Ribosoom Bound Nascent Polypeptiden<em&gt; In vitro</em&gt; Om Translationeel Pauze plaatsen langs mRNA identificeren

The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the ...

Using SecM Arrest Sequence as a Tool to Isolate Ribosome Bound Polypeptides

Met behulp van SecM Arrestatie sequentie als een Tool om Ribosoom Bound Polypeptiden Isoleer

Extensive research has provided ample evidences suggesting that protein folding in the cell is a co-translational process1-5. However, the exact pathway ...

Agroinfiltration and PVX Agroinfection in Potato and Nicotiana benthamiana

Agroinfiltration and PVX Agroinfection in Potato and Nicotiana benthamiana

Agro-infiltratie en PVX Agro-infectie in aardappel en Nicotiana benthamiana

Agroinfiltration and PVX agroinfection are two efficient transient expression assays for functional analysis of candidate genes in plants. The most ...

Optimization and Utilization of Agrobacterium-mediated Transient Protein Production in Nicotiana

Optimization and Utilization of Agrobacterium-mediated Transient Protein Production in Nicotiana

Optimalisatie en het gebruik van<em&gt; Agrobacterium</em&gt;-Gemedieerde Transient eiwitproductie in<em&gt; Nicotiana</em

Agrobacterium-mediated transient protein production in plants is a promising approach to produce vaccine antigens and therapeutic proteins within a short ...

Chitosan/Interfering RNA Nanoparticle Mediated Gene Silencing in Disease Vector Mosquito Larvae

Chitosan / interfererende RNA nanodeeltjes gemedieerde gen silencing in Disease Vector muggenlarven

Vector mosquitoes inflict more human suffering than any other organism&#8212;and kill more than one million people each year. The mosquito genome projects ...

Meiotic Spindle Assessment in Mouse Oocytes by siRNA-mediated Silencing

Meiotische Spil Assessment in Muis Eicellen door siRNA-gemedieerde silencing

Errors in chromosome segregation during meiotic division in gametes can lead to aneuploidy that is subsequently transmitted to the embryo upon ...

Luciferase Complementation Imaging Assay in Nicotiana benthamiana Leaves for Transiently Determining Protein-protein Interaction Dynamics

Luciferase Complementation Imaging Assay in Nicotiana benthamiana Leaves for Transiently Determining Protein-protein Interaction Dynamics

Luciferase complementatie Imaging Assay in Nicotiana benthamiana bladeren voor Transient bepalen eiwit-eiwit interactie Dynamics

Protein-protein interactions are fundamental mechanisms for relaying signal transduction in most cellular processes; therefore, identification of novel ...