Name: detection of protein ubiquitination
Uploaded: 2009-08-19T00:00:00
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Este trabalho foi financiado pelo NIH concede RO1 DC006497, RO1 NS057289, e PO1 ES016738 (a Z. Zhang); California Institute de Medicina Regenerativa concede RS1-00331-1 e RL1-00682-1 (a Z. Zhang), a americana Parkinson doença Association (a Z. Zhang e Choo YS) e do Michael J. Fox Foundation for Research Parkinson (Z. Zhang).

Detecção de ubiquitinação de proteínas em células cultivadas <ol><li> Transfecção as células cultivadas com plasmídeos expressando a proteína de interesse e (epítopo-tagged versão) ubiquitina. </li><li> Faça lise completa das células (2% SDS, 150 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl, pH 8,0) com 2mM ortovanadato de sódio, 50 mM de fluoreto de sódio, e os inibidores da protease. </li><li> Lisar células com 100 mL de buffer de células por placa de lise (6 prato cm). Se uma antena maior é usado, ajustar o volume e...

<ol>
	<li>Xiong, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PINK1,+and+DJ-1+form+a+ubiquitin+E3+ligase+complex+promoting+unfolded+protein+degradation.">PINK1, and DJ-1 form a ubiquitin E3 ligase complex promoting unfolded protein degradation.</a> J Clin Invest. 119, 650-660 (2009).</li><li>Xirodimas, D. P., Saville, M. K., Bourdon, J. C., Hay, R. T., Lane, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mdm2-mediated+NEDD8+conjugation+of+p53+inhibits+its+transcriptional+activity.">Mdm2-mediated NEDD8 conjugation of p53 inhibits its transcriptional activity.</a> Cell. 118, 83-97 (2004).</li><li>Didier, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNF5,+a+RING+finger+protein+that+regulates+cell+motility+by+targeting+paxillin+ubiquitination+and+altered+localization.">RNF5, a RING finger protein that regulates cell motility by targeting paxillin ubiquitination and altered localization.</a> Mol Cell Biol. 23, 5331-5345 (2003).</li><li>Laney, J. D., Hochsetrasser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unit+14.5+Analysis+of+Protein+Ubiquitination.">Unit 14.5 Analysis of Protein Ubiquitination.</a> Current Protocols in Protein Science. , 14.5.1-14.5.11 (2002).</li></ol>

Nesta apresentação, descrita pela primeira vez os passos que permitem a detecção de modificação ubiquitina em uma proteína de interesse em culturas de células de mamíferos. A fim de detectar ubiquitinação especificamente sobre a proteína de interesse, e não sobre proteínas não-covalentemente interagindo, usamos uma condição rigorosos para a lise celular, imunoprecipitação e lavagem 1,3. Ubiquitinação, detectadas por imunoprecipitação de proteínas-alvo em uma condição tão dura seguid...

detection of protein ubiquitination

Ubiquitinação, a ligação covalente da ubiquitina polipeptídeo como alvo as proteínas, é uma modificação fundamental posttranslational realizado por um conjunto de três enzimas. Eles incluem a ativação da enzima ubiquitina-E1, E2 conjugando ubiquitina-enzima, e E3 ubiquitina ligase. Ao contrário de E1 e E2, E3 ubiquitina ligases especificidade substrato mostrar. Por outro lado, numerosas enzimas deubiquitylating têm funções no processamento de proteínas poliubiquinadas. Ubiquitinação pode resultar em mudança de estabilidade da proteína, localização celular e atividade biológica. Mutações de genes envolvidas na via ubiquitinação / deubiquitination ou função alterada do sistema ubiquitina estão associadas com diversas doenças humanas, como vários tipos de cancer, neurodegeneração, e distúrbios metabólicos. A detecção de ubiquitinação alterado ou normal de proteínas-alvo pode fornecer uma melhor compreensão sobre a patogênese dessas doenças. Aqui, descrevemos os protocolos para detectar ubiquitinação de proteínas em células cultivadas<em&gt; In vivo</emTubos&gt; e testar<em&gt; In vitro</em&gt;. Estes protocolos também são úteis para detectar outras ubiquitina-like modificação pequena molécula, como sumolyation e neddylation.

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Detection of Protein Ubiquitination

Ubiquitinação é uma modificação fundamental posttranslational realizado por um conjunto de três enzimas. Mutações dos genes envolvidos nesta modificação estão associadas com diferentes tipos de doenças humanas. Aqui, descrevemos os protocolos para detectar ubiquitinação de proteínas em células cultivadas<em&gt; In vivo</emTubos&gt; e testar<em&gt; In vitro</em&gt;.

Detecção de Ubiquitinação Protein

Ubiquitination, the covalent attachment of the polypeptide ubiquitin to target proteins, is a key posttranslational modification carried out by a set of ...

Research

JoVE Journal

Biology

Batch Immunostaining for Large-Scale Protein Detection in the Whole Monkey Brain

A imunocoloração lote de Grande Escala da detecção de proteínas no cérebro do macaco inteiro

Immunohistochemistry (IHC) is one of the most widely used laboratory techniques for the detection of target proteins in situ. Questions concerning the ...

Biologia

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

Coloração de proteínas em géis com Coomassie G-250 sem ácido acético e Solventes Orgânicos

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Using the GELFREE 8100 Fractionation System for Molecular Weight-Based Fractionation with Liquid Phase Recovery

Usando o sistema de fracionamento GELFREE 8100 para Fracionamento baseada no peso molecular com Recovery Fase Líquida

The GELFREE 8100 Fractionation System is a novel protein fractionation system designed to maximize protein recovery during molecular weight based ...

In-vivo Detection of Protein-protein Interactions on Micro-patterned Surfaces

In-vivo Detection of Protein-protein Interactions on Micro-patterned Surfaces

In vivo Detecção de interações proteína-proteína em Micro-padrão Superfícies

Unraveling the interaction network of molecules in-vivo is key to understanding the mechanisms that regulate cell function and metabolism. A multitude of ...

Detection of Protein Interactions in Plant using a Gateway Compatible Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) System

Detection of Protein Interactions in Plant using a Gateway Compatible Bimolecular Fluorescence Complementation BiFC System

Detecção de interações proteína na planta através de um gateway de Complementação de fluorescência Compatível Bimolecular (BiFC) Sistema

We have developed a BiFC technique to test the interaction between two proteins in vivo. This is accomplished by splitting a yellow fluorescent protein ...

siRNA Screening to Identify Ubiquitin and Ubiquitin-like System Regulators of Biological Pathways in Cultured Mammalian Cells

Screening siRNA identificar Ubiquitin e ubiquitina-como reguladores do sistema de caminhos biológicos em células de mamíferos cultivadas

Post-translational modification of proteins with ubiquitin and ubiquitin-like molecules (UBLs) is emerging as a dynamic cellular signaling network that ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

Verde Fluorescente à base de proteínas Expressão Rastreio de Proteínas de Membrana em<em&gt; Escherichia coli</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...

Protein Purification Technique that Allows Detection of Sumoylation and Ubiquitination of Budding Yeast Kinetochore Proteins Ndc10 and Ndc80

Técnica de purificação de proteína que permite a detecção de SUMOilação e Ubiquitination de brotamento Yeast kinetochore Proteínas Ndc10 e Ndc80

Post-translational Modifications (PTMs), such as phosphorylation, methylation, acetylation, ubiquitination, and sumoylation, regulate the cellular ...

Detection of Ligand-activated G Protein-coupled Receptor Internalization by Confocal Microscopy

Detecção de activados por ligandos L acoplado a proteína do receptor de internalização por Microscopia Confocal

Confocal laser scanning microscopy (CLSM) is an optical imaging technique for high-contrast imaging. It is a powerful approach to visualize fluorescent ...

In Vivo Detection and Analysis of Rb Protein SUMOylation in Human Cells

In Vivo Detection and Analysis of Rb Protein SUMOylation in Human Cells

Na Vivo Detecção e análise de SUMOylation de proteína Rb em células humanas

The post-translational modifications of proteins are critical for the proper regulation of intracellular signal transduction. Among these modifications, ...