Name: imaging exocytosis in retinal bipolar cells with tirf microscopy
Uploaded: 2009-06-09T00:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Imaging Exocytosis in Retinal Bipolar Cells with TIRF Microscopy at JoVE.com

Dit werk werd ondersteund door NIH Grant EY 14.990.

Deel 1: Dissection en bipolaire celisolatie <ol><li> Bereid oplossingen opgenomen in tabel 2; De pH van Ringers &#39;(extern) oplossingen moeten worden aangepast aan de 7.4 met NaOH en de pH van de interne oplossing dient te worden aangepast tot 7,2 met CsOH. Bescherm de interne oplossing tegen licht af met aluminiumfolie en houd het bij 4 ° C tot gebruik; </li><li> Dark-aan te passen een goudvis minstens 30 minuten voor dissectie; </li><li> Terwijl het dier donker past, voor te bereiden 5 ml van de hyaluronidase (ty...

<ol>
	<li>Axelrod, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Total+internal+reflection+fluorescence+microscopy+in+cell+biology.">Total internal reflection fluorescence microscopy in cell biology.</a> Traffic. 2, 764-774 (2001).</li><li>Zenisek, D., Steyer, J. A., Almers, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transport,+capture+and+exocytosis+of+single+synaptic+vesicles+at+active+zones.">Transport, capture and exocytosis of single synaptic vesicles at active zones.</a> Nature. 406, 849-854 (2000).</li><li>Zenisek, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vesicle+association+and+exocytosis+at+ribbon+and+extraribbon+sites+in+retinal+bipolar+cell+presynaptic+terminals.">Vesicle association and exocytosis at ribbon and extraribbon sites in retinal bipolar cell presynaptic terminals.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 105, 4922-4927 (2008).</li><li>Zenisek, D., Horst, N. K., Merrifield, C., Sterling, P., Matthews, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+synaptic+ribbons+in+the+living+cell.">Visualizing synaptic ribbons in the living cell.</a> J. Neurosci. 24, 9752-9759 (2004).</li><li>Axelrod, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+imaging+of+surface+fluorescence+with+very+high+aperture+microscope+objectives.">Selective imaging of surface fluorescence with very high aperture microscope objectives.</a> J. Biomed. Opt. 6, 6-13 (2001).</li><li>Rouze, N. C., Schwartz, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Continous+and+transient+vesicle+cycling+at+a+ribbon+synapse.">Continous and transient vesicle cycling at a ribbon synapse.</a> J. Neurosci. 18, 8614-8624 (1998).</li></ol>

De voordelen van objectieve-type TIRF microscopie zijn dat 1) het uitstekende optische sectie biedt door het beperken van excitatie licht naar een smal gebied in het brandvlak van de doelstelling, waardoor het minimaliseren van out-of-focus licht, 2) omdat het licht daalt exponentieel met de afstand kan beweging in een verticale richting worden gevolgd als een verandering in de fluorescentie-intensiteit, 3) efficiënte licht collectie door de hoge numerieke apertuur doel 1,5. Het belangrijkste nadeel van de techniek is da...

imaging exocytosis in retinal bipolar cells with tirf microscopy

Totale interne reflectie fluorescentie (TIRF) microscopie is een techniek die de studie van de gebeurtenissen op het celmembraan kunnen door selectieve beeldvorming van fluorescerende moleculen die het dichtst bij een hoge brekingsindex stof zoals glas<sup&gt; 1</sup&gt;. In dit artikel, passen we deze techniek om de afbeelding exocytose van synaptische blaasjes in retinale bipolaire cellen geïsoleerd uit de goudvis netvlies. Deze neuronen zijn zeer geschikt voor dit soort van onderzoek vanwege hun grote axon terminals. Door het gelijktijdig patch het vastklemmen van de bipolaire cellen, is het mogelijk om de relatie tussen pre-synaptische spanning en synaptische los<sup&gt; 2,3</sup&gt;. Synaptische blaasjes in de bipolaire cel terminals worden geladen met een fluorescerende kleurstof (FM 1-43 ®) door co-puffend de kleurstof en een ringer oplossing met een hoge K<sup&gt; +</sup&gt; De concentratie op de synaptische terminals. Dit depolariseert de cellen en stimuleert endocytose en de daaruit voortvloeiende kleurstof opname in het glutamaat blaasjes. Na het wassen de overtollige kleurstof weg voor ongeveer 30 minuten, cellen zijn er klaar voor zijn patch geklemd en afgebeeld gelijktijdig met een 488 nm laser. De patch pipet oplossing bevat een rhodamine-based peptide dat selectief bindt aan de synaptische lint eiwit ribeye<sup&gt; 4</sup&gt;, Waardoor de etikettering linten in het bijzonder wanneer terminals zijn afgebeeld met een 561 nm laser. Hierdoor kan de precieze lokalisatie van de actieve zones en de scheiding van synaptische van extra-synaptische evenementen.

Watch this Scientific Journal Video about Imaging Exocytosis in Retinal Bipolar Cells with TIRF Microscopy at JoVE.com

Imaging Exocytosis in Retinal Bipolar Cells with TIRF Microscopy

In deze video laten we zien hoe te labelen en te visualiseren enkele synaptische blaasjes exocytose en handel in goudvissen het netvlies bipolaire cellen met behulp van totale interne reflectie fluorescentie (TIRF) microscopie.

Imaging exocytose in het netvlies bipolaire cellen met TIRF Microscopie

Total internal reflectance fluorescence (TIRF) microscopy is a technique that allows the study of events happening at the cell membrane, by selective ...

Research

JoVE Journal

Biology

Measuring Exocytosis in Neurons Using FM Labeling

Het meten van exocytose in Neuronen FM-ontvanger voor Labeling

The ability to measure the kinetics of vesicle release can help provide insight into some of the basics of neurotransmission.  Here we used real-time ...

Long-term Imaging Mammalian Cells using Wide-Field Microscopy

Op lange termijn Imaging zoogdiercellen met behulp van Wide-Field Microscopie

Labeling Stem Cells with Fluorescent Dyes for non-invasive Detection with Optical Imaging

Labeling stamcellen met fluorescente kleurstoffen voor niet-invasieve detectie met optische beeldvorming

Optical imaging (OI) is an easy, fast and inexpensive tool for in vivo monitoring of new stem cell based therapies. The technique is based on ex vivo ...

Fluorescence-based Measurement of Store-operated Calcium Entry in Live Cells: from Cultured Cancer Cell to Skeletal Muscle Fiber

Fluorescentie-gebaseerde waardering van Store-bediende Calcium Entry in levende cellen: van Cultured Cancer Cell op Skeletal Muscle Fiber

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

In Vivo 4-dimensionale Tracking van hematopoietische stamcellen en progenitorcellen in volwassen muis calvarial Bone Marrow

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Fluorescence Imaging with One-nanometer Accuracy (FIONA)

Fluorescence Imaging with One-nanometer Accuracy FIONA

Fluorescentie Imaging met One-nanometer nauwkeurigheid (FIONA)

Fluorescence imaging with one-nanometer accuracy (FIONA) is a simple but useful technique for localizing single fluorophores with nanometer precision in ...

Tandem High-pressure Freezing and Quick Freeze Substitution of Plant Tissues for Transmission Electron Microscopy

Tandem Hogedruk Invriezen en Quick Freeze Vervanging van plantaardige weefsels voor Transmission Electron Microscopy

Since the 1940s transmission electron microscopy (TEM) has been providing biologists with ultra-high resolution images of biological materials. Yet, ...

A Graphical User Interface for Software-assisted Tracking of Protein Concentration in Dynamic Cellular Protrusions

Een grafische gebruikersinterface voor software-assisted tracking van eiwitconcentratie in dynamische cellulaire protrusies

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex ...

Imaging FITC-dextran as a Reporter for Regulated Exocytosis

Imaging FITC-dextran als verslaggever voor gereglementeerde exocytose

Regulated exocytosis is a process by which cargo, which is stored in secretory granules (SGs), is released in response to a secretory trigger. Regulated ...

Biological Sample Preparation by High-pressure Freezing, Microwave-assisted Contrast Enhancement, and Minimal Resin Embedding for Volume Imaging

Bereiding van de biologische monsters door hogedruk bevriezing, magnetron-bijgewoonde contrastverbetering, en minimale hars inbedding voor Volume Imaging

The described sample preparation technique is designed to combine the best quality of ultrastructural preservation with the most suitable contrast for the ...