Name: imaging exocytosis in retinal bipolar cells with tirf microscopy
Uploaded: 2009-06-09T00:00:00
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Questo lavoro è stato sostenuto da NIH di Grant EY 14990.

Parte 1: Dissection e cella di isolamento bipolare <ol><li> Preparare le soluzioni di cui alla tabella 2; Il pH delle suonerie &#39;(esterni) le soluzioni devono essere regolato a 7,4 con NaOH e il pH della soluzione interna deve essere regolato a 7,2 con CsOH. Proteggere la soluzione dalla luce interna con foglio di alluminio e conservarlo a 4 ° C fino all&#39;utilizzo; </li><li> Dark-adattare un pesce rosso per almeno 30 minuti prima della dissezione; </li><li> Mentre l&#39;animale scuro si adatta, preparare 5 ml d...

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	<li>Axelrod, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Total+internal+reflection+fluorescence+microscopy+in+cell+biology.">Total internal reflection fluorescence microscopy in cell biology.</a> Traffic. 2, 764-774 (2001).</li><li>Zenisek, D., Steyer, J. A., Almers, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transport,+capture+and+exocytosis+of+single+synaptic+vesicles+at+active+zones.">Transport, capture and exocytosis of single synaptic vesicles at active zones.</a> Nature. 406, 849-854 (2000).</li><li>Zenisek, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vesicle+association+and+exocytosis+at+ribbon+and+extraribbon+sites+in+retinal+bipolar+cell+presynaptic+terminals.">Vesicle association and exocytosis at ribbon and extraribbon sites in retinal bipolar cell presynaptic terminals.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 105, 4922-4927 (2008).</li><li>Zenisek, D., Horst, N. K., Merrifield, C., Sterling, P., Matthews, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+synaptic+ribbons+in+the+living+cell.">Visualizing synaptic ribbons in the living cell.</a> J. Neurosci. 24, 9752-9759 (2004).</li><li>Axelrod, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+imaging+of+surface+fluorescence+with+very+high+aperture+microscope+objectives.">Selective imaging of surface fluorescence with very high aperture microscope objectives.</a> J. Biomed. Opt. 6, 6-13 (2001).</li><li>Rouze, N. C., Schwartz, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Continous+and+transient+vesicle+cycling+at+a+ribbon+synapse.">Continous and transient vesicle cycling at a ribbon synapse.</a> J. Neurosci. 18, 8614-8624 (1998).</li></ol>

I vantaggi di tipo oggettivo-microscopia TIRF sono che: 1) fornisce un&#39;eccellente sezionamento ottico limitando luce di eccitazione ad una regione ristretta all&#39;interno del piano focale dell&#39;obiettivo, minimizzando così out-of-focus luce, 2) in quanto la luce diminuisce esponenzialmente con la distanza , il movimento in direzione verticale può essere monitorato come un cambiamento di intensità di fluorescenza, 3) la raccolta efficiente luce attraverso l&#39;obiettivo ad alta apertura numerica 1,5. Il princi...

imaging exocytosis in retinal bipolar cells with tirf microscopy

Fluorescenza di riflessione interna totale (TIRF) microscopia è una tecnica che permette lo studio di eventi che accadono a livello della membrana cellulare, con immagini selettivo di molecole fluorescenti che sono più vicini ad una sostanza alto indice di rifrazione come il vetro<sup&gt; 1</sup&gt;. In questo articolo, si applica questa tecnica per esocitosi immagine delle vescicole sinaptiche nelle cellule bipolari della retina isolata dalla retina pesci rossi. Questi neuroni sono molto adatti per questo tipo di studio a causa della loro terminali degli assoni di grandi dimensioni. Contemporaneamente cerotto di fissaggio le cellule bipolari, è possibile indagare il rapporto tra pre-sinaptica di tensione e rilascio sinaptico<sup&gt; 2,3</sup&gt;. Vescicole sinaptiche terminali all&#39;interno delle cellule del bipolare sono caricati con un colorante fluorescente (FM 1-43 ®) per co-sbuffando il colorante e una soluzione contenente una suoneria alta K<sup&gt; +</supConcentrazione&gt; sui terminali sinaptici. Questo depolarizza le cellule e stimola endocitosi e conseguente assorbimento colorante in vescicole glutamatergica. Dopo aver lavato il colorante in eccesso per circa 30 minuti, le cellule sono pronte per essere cerotto bloccato e ripreso in contemporanea con un laser a 488 nm. La soluzione contiene una pipetta di patch rodamina basata peptide che si lega selettivamente alla proteina sinaptica Ribeye nastro<sup&gt; 4</sup&gt;, In tal modo l&#39;etichettatura nastri specificamente quando i terminali sono ripreso con un laser a 561 nm. Questo permette la localizzazione precisa delle zone attive e la separazione della sinaptica da eventi extra-sinaptico.

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Imaging Exocytosis in Retinal Bipolar Cells with TIRF Microscopy

In questo video ci dimostra come etichettare e visualizzare singole esocitosi delle vescicole sinaptiche e la tratta di pesci rossi cellule bipolari della retina mediante fluorescenza di riflessione interna totale (TIRF) microscopia.

Esocitosi imaging in cellule bipolari della retina con microscopia TIRF

Total internal reflectance fluorescence (TIRF) microscopy is a technique that allows the study of events happening at the cell membrane, by selective ...

Research

JoVE Journal

Biology

Measuring Exocytosis in Neurons Using FM Labeling

Misurare esocitosi nei neuroni Utilizzando Etichettatura FM

The ability to measure the kinetics of vesicle release can help provide insight into some of the basics of neurotransmission.  Here we used real-time ...

Ricerca

Biologia

Long-term Imaging Mammalian Cells using Wide-Field Microscopy

A lungo termine Imaging cellule di mammifero utilizzando Wide-Field Microscopia

Labeling Stem Cells with Fluorescent Dyes for non-invasive Detection with Optical Imaging

Etichettatura Cellule staminali con le tinture fluorescenti per la rilevazione non invasiva con Optical Imaging

Optical imaging (OI) is an easy, fast and inexpensive tool for in vivo monitoring of new stem cell based therapies. The technique is based on ex vivo ...

Fluorescence-based Measurement of Store-operated Calcium Entry in Live Cells: from Cultured Cancer Cell to Skeletal Muscle Fiber

Basato sulla fluorescenza Misura Store-Entry operato di calcio in cellule vive: dal Cancer Cell coltura per fibra muscolare scheletrica

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

In Vivo inseguimento 4-dimensionale di emopoietiche staminali e progenitrici celle di topo adulto cranica di Midollo Osseo

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Fluorescence Imaging with One-nanometer Accuracy (FIONA)

Fluorescence Imaging with One-nanometer Accuracy FIONA

Imaging di fluorescenza con One nanometri Precisione (FIONA)

Fluorescence imaging with one-nanometer accuracy (FIONA) is a simple but useful technique for localizing single fluorophores with nanometer precision in ...

Tandem High-pressure Freezing and Quick Freeze Substitution of Plant Tissues for Transmission Electron Microscopy

Tandem congelamento ad alta pressione e congelamento rapido Sostituzione di tessuti vegetali per la microscopia elettronica a trasmissione

Since the 1940s transmission electron microscopy (TEM) has been providing biologists with ultra-high resolution images of biological materials. Yet, ...

A Graphical User Interface for Software-assisted Tracking of Protein Concentration in Dynamic Cellular Protrusions

Un&#39;interfaccia utente grafica per il monitoraggio assistito della concentrazione di proteine ​​in protrusioni cellulari dinamiche

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex ...

Imaging FITC-dextran as a Reporter for Regulated Exocytosis

FITC-Destrano di imaging come Reporter per esocitosi regolata

Regulated exocytosis is a process by which cargo, which is stored in secretory granules (SGs), is released in response to a secretory trigger. Regulated ...

Biological Sample Preparation by High-pressure Freezing, Microwave-assisted Contrast Enhancement, and Minimal Resin Embedding for Volume Imaging

Preparazione del campione biologico di congelamento ad alta pressione, aumento di contrasto assistita da microonde e Minimal resina incorporamento per Imaging con volumi

The described sample preparation technique is designed to combine the best quality of ultrastructural preservation with the most suitable contrast for the ...