Name: imaging exocytosis in retinal bipolar cells with tirf microscopy
Uploaded: 2009-06-09T00:00:00
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Este trabalho foi financiado pelo NIH Grant EY 14.990.

Parte 1: Dissecção e isolamento de células Bipolar <ol><li> Preparar soluções listadas na Tabela 2; O pH de toques &quot;(externa) de soluções deve ser ajustado para 7,4 com NaOH e do pH da solução interna deve ser ajustado para 7,2 com CsOH. Proteger a solução interna da luz com papel alumínio e mantenha-o a 4 ° C até o uso; </li><li> Dark-se adaptar um peixinho dourado, pelo menos, 30 minutos antes da dissecção; </li><li> Enquanto o animal se adapta-escuro, preparar 5 mL de hialuronidase (V tipo hial...

<ol>
	<li>Axelrod, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Total+internal+reflection+fluorescence+microscopy+in+cell+biology.">Total internal reflection fluorescence microscopy in cell biology.</a> Traffic. 2, 764-774 (2001).</li><li>Zenisek, D., Steyer, J. A., Almers, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transport,+capture+and+exocytosis+of+single+synaptic+vesicles+at+active+zones.">Transport, capture and exocytosis of single synaptic vesicles at active zones.</a> Nature. 406, 849-854 (2000).</li><li>Zenisek, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vesicle+association+and+exocytosis+at+ribbon+and+extraribbon+sites+in+retinal+bipolar+cell+presynaptic+terminals.">Vesicle association and exocytosis at ribbon and extraribbon sites in retinal bipolar cell presynaptic terminals.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 105, 4922-4927 (2008).</li><li>Zenisek, D., Horst, N. K., Merrifield, C., Sterling, P., Matthews, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+synaptic+ribbons+in+the+living+cell.">Visualizing synaptic ribbons in the living cell.</a> J. Neurosci. 24, 9752-9759 (2004).</li><li>Axelrod, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+imaging+of+surface+fluorescence+with+very+high+aperture+microscope+objectives.">Selective imaging of surface fluorescence with very high aperture microscope objectives.</a> J. Biomed. Opt. 6, 6-13 (2001).</li><li>Rouze, N. C., Schwartz, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Continous+and+transient+vesicle+cycling+at+a+ribbon+synapse.">Continous and transient vesicle cycling at a ribbon synapse.</a> J. Neurosci. 18, 8614-8624 (1998).</li></ol>

As vantagens do objectivo do tipo de microscopia TIRF são que 1) ele fornece seccionamento óptico excelente restringindo luz de excitação a uma estreita região dentro do plano focal da objetiva, minimizando assim o fora-de-foco de luz, 2) já que a luz cai exponencialmente com a distância , o movimento em uma direção vertical pode ser monitorado como uma mudança na intensidade de fluorescência, 3) a coleta de luz eficiente através do objectivo de alta abertura numérica 1,5. A principal desvantagem da técnica ...

imaging exocytosis in retinal bipolar cells with tirf microscopy

Refletância interna total de fluorescência microscopia (TIRF) é uma técnica que permite o estudo dos eventos que acontecem na membrana celular, pela imagem seletiva de moléculas fluorescentes que são mais próximos a uma substância de alto índice de refração, como vidro<sup&gt; 1</sup&gt;. Neste artigo, nós aplicamos essa técnica para exocitose imagem de vesículas sinápticas em células da retina bipolar isolado da retina goldfish. Esses neurônios são muito adequados para esse tipo de estudo, devido à sua terminais dos axônios de grande porte. Ao mesmo tempo patch clamping as células bipolares, é possível investigar a relação entre pré-sináptica de tensão e liberação sináptica<sup&gt; 2,3</sup&gt;. Vesículas sinápticas no interior da célula bipolar terminais são carregados com um corante fluorescente (FM 1-43 ®) por co-puffing o corante e uma solução contendo um toque de alto K<sup&gt; +</sup&gt; Concentração para os terminais sinápticos. Este despolariza as células e estimula a endocitose e conseqüente captação de corante em vesículas glutamatérgica. Depois de lavar o excesso de corante afastado por cerca de 30 minutos, as células estão prontos para ser pinçada e correção representados simultaneamente com um laser nm 488. A solução da pipeta patch contém um peptídeo rodamina-base que se liga seletivamente ao olho de lombo sináptica fita de proteína<sup&gt; 4</sup&gt;, Assim, a rotulagem fitas especificamente quando os terminais são gravadas com um laser nm 561. Isso permite que a localização precisa das zonas de ativos e da separação dos sináptica de extra-sináptica eventos.

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Imaging Exocytosis in Retinal Bipolar Cells with TIRF Microscopy

Neste vídeo, demonstramos como rotular e visualizar exocitose das vesículas sinápticas única e tráfico de células da retina goldfish bipolar usando reflexão interna total de fluorescência microscopia (TIRF).

Exocitose imagem em células da retina com Bipolar Microscopia TIRF

Total internal reflectance fluorescence (TIRF) microscopy is a technique that allows the study of events happening at the cell membrane, by selective ...

Research

JoVE Journal

Biology

Measuring Exocytosis in Neurons Using FM Labeling

Medição Exocitose em Neurônios Usando Labeling FM

The ability to measure the kinetics of vesicle release can help provide insight into some of the basics of neurotransmission.  Here we used real-time ...

Biologia

Long-term Imaging Mammalian Cells using Wide-Field Microscopy

Longo prazo células de mamíferos utilizando imagens do Largo-Campo Microscopia

Labeling Stem Cells with Fluorescent Dyes for non-invasive Detection with Optical Imaging

Rotulagem células-tronco com corantes fluorescentes para detecção não invasiva com imagens ópticas

Optical imaging (OI) is an easy, fast and inexpensive tool for in vivo monitoring of new stem cell based therapies. The technique is based on ex vivo ...

Fluorescence-based Measurement of Store-operated Calcium Entry in Live Cells: from Cultured Cancer Cell to Skeletal Muscle Fiber

Fluorescência baseada em Medição da loja operada entrada de cálcio em células vivas: a partir de células cancerosas cultivadas em fibra muscular esquelética

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

In Vivo Rastreamento 4-Dimensional de tronco hematopoéticas e células progenitoras em adultos mouse na calota craniana de Medula Óssea

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Fluorescence Imaging with One-nanometer Accuracy (FIONA)

Fluorescence Imaging with One-nanometer Accuracy FIONA

Imagens de fluorescência com um nanômetros Precisão (Fiona)

Fluorescence imaging with one-nanometer accuracy (FIONA) is a simple but useful technique for localizing single fluorophores with nanometer precision in ...

Tandem High-pressure Freezing and Quick Freeze Substitution of Plant Tissues for Transmission Electron Microscopy

Tandem congelamento de pressão alta e rápida substituição em congelamento dos tecidos vegetais por Microscopia Eletrônica de Transmissão

Since the 1940s transmission electron microscopy (TEM) has been providing biologists with ultra-high resolution images of biological materials. Yet, ...

A Graphical User Interface for Software-assisted Tracking of Protein Concentration in Dynamic Cellular Protrusions

Uma interface de usuário gráfica para rastreamento assistido por software da concentração de proteínas em protrusões celulares dinâmicas

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex ...

Imaging FITC-dextran as a Reporter for Regulated Exocytosis

Imagem latente FITC-dextrano como repórter por exocitose regulada

Regulated exocytosis is a process by which cargo, which is stored in secretory granules (SGs), is released in response to a secretory trigger. Regulated ...

Biological Sample Preparation by High-pressure Freezing, Microwave-assisted Contrast Enhancement, and Minimal Resin Embedding for Volume Imaging

Preparação de amostras biológicas por congelamento de alta pressão, realce de contraste assistida por microondas e resina mínima incorporação para a imagem latente de Volume

The described sample preparation technique is designed to combine the best quality of ultrastructural preservation with the most suitable contrast for the ...