Name: imaging exocytosis in retinal bipolar cells with tirf microscopy
Uploaded: 2009-06-09T00:00:00
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Este trabajo fue apoyado por el NIH subvención EY 14990.

Parte 1: La disección y aislamiento de células bipolares <ol><li> Preparar las soluciones en la Tabla 2, el pH de timbres &quot;(externo) de soluciones debe ajustarse a 7,4 con NaOH y el pH de la solución interna debe ser ajustado a 7,2 con CsOH. Proteja la solución interna de la luz con papel de aluminio y conservar a 4 ° C hasta su uso; </li><li> Dark-un pez de colores para adaptarse al menos 30 minutos antes de la disección; </li><li> Mientras que el animal se adapta oscuro, preparar 5 ml de la hialuronidasa ...

<ol>
	<li>Axelrod, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Total+internal+reflection+fluorescence+microscopy+in+cell+biology.">Total internal reflection fluorescence microscopy in cell biology.</a> Traffic. 2, 764-774 (2001).</li><li>Zenisek, D., Steyer, J. A., Almers, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transport,+capture+and+exocytosis+of+single+synaptic+vesicles+at+active+zones.">Transport, capture and exocytosis of single synaptic vesicles at active zones.</a> Nature. 406, 849-854 (2000).</li><li>Zenisek, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vesicle+association+and+exocytosis+at+ribbon+and+extraribbon+sites+in+retinal+bipolar+cell+presynaptic+terminals.">Vesicle association and exocytosis at ribbon and extraribbon sites in retinal bipolar cell presynaptic terminals.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 105, 4922-4927 (2008).</li><li>Zenisek, D., Horst, N. K., Merrifield, C., Sterling, P., Matthews, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+synaptic+ribbons+in+the+living+cell.">Visualizing synaptic ribbons in the living cell.</a> J. Neurosci. 24, 9752-9759 (2004).</li><li>Axelrod, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+imaging+of+surface+fluorescence+with+very+high+aperture+microscope+objectives.">Selective imaging of surface fluorescence with very high aperture microscope objectives.</a> J. Biomed. Opt. 6, 6-13 (2001).</li><li>Rouze, N. C., Schwartz, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Continous+and+transient+vesicle+cycling+at+a+ribbon+synapse.">Continous and transient vesicle cycling at a ribbon synapse.</a> J. Neurosci. 18, 8614-8624 (1998).</li></ol>

Las ventajas de los objetivos de tipo de microscopía TIRF son: 1) que proporciona seccionamiento óptico excelente mediante la restricción de la luz de excitación a una región estrecha en el plano focal del objetivo, minimizando de esta manera fuera del foco de luz, 2) ya que la luz disminuye exponencialmente con la distancia , el movimiento en sentido vertical se puede controlar con un cambio en la intensidad de la fluorescencia, 3) la colección de bajo consumo a través del objetivo de gran apertura numérica de 1,5. <...

imaging exocytosis in retinal bipolar cells with tirf microscopy

Total de reflexión interna de fluorescencia (TIRF) microscopía es una técnica que permite el estudio de los acontecimientos que suceden en la membrana celular, por la imagen selectiva de moléculas fluorescentes que están más cerca de una sustancia alto índice de refracción, como el vidrio<sup&gt; 1</sup&gt;. En este artículo, se aplica esta técnica a la exocitosis la imagen de las vesículas sinápticas en la retina las células bipolares aislados de la retina peces de colores. Estas neuronas son muy adecuados para este tipo de estudios debido a sus grandes terminales de los axones. Al mismo tiempo patch clamp las células bipolares, es posible investigar la relación entre la pre-sináptica de tensión y liberación sináptica<sup&gt; 2,3</sup&gt;. Las vesículas sinápticas dentro de las terminales de células bipolares se cargan con un tinte fluorescente (FM 1-43 ®) por la co-fumando el tinte y una solución de Ringer que contiene un alto K<sup&gt; +</sup&gt; Concentración en los terminales sinápticos. Esto despolariza las células y estimula la absorción de colorante endocitosis y consecuente en las vesículas glutamatérgicas. Después de lavar el exceso de tinte de distancia de alrededor de 30 minutos, las células están listas para ser sujeta de parches y la imagen al mismo tiempo con un láser de 488 nm. La solución de la pipeta parche contiene un péptido rodamina basado en que se une selectivamente a la cinta RIBEYE proteína sináptica<sup&gt; 4</sup&gt;, Con lo que el etiquetado cintas específicamente cuando los terminales son imágenes con un láser de 561 nm. Esto permite la localización precisa de las zonas activas y la separación de sináptica de extra-sináptica eventos.

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Imaging Exocytosis in Retinal Bipolar Cells with TIRF Microscopy

En este video, que muestra cómo la etiqueta y visualizar solo exocitosis de vesículas sinápticas y el tráfico en las células de la retina con peces de colores bipolar total de fluorescencia de reflexión interna (TIRF) microscopía.

Imágenes de exocitosis en las células bipolares de retina con microscopía TIRF

Total internal reflectance fluorescence (TIRF) microscopy is a technique that allows the study of events happening at the cell membrane, by selective ...

Research

JoVE Journal

Biology

Measuring Exocytosis in Neurons Using FM Labeling

La medición de la exocitosis en las neuronas de un etiquetado FM

The ability to measure the kinetics of vesicle release can help provide insight into some of the basics of neurotransmission.  Here we used real-time ...

Investigación

Biología

Long-term Imaging Mammalian Cells using Wide-Field Microscopy

A largo plazo de imágenes usando las células de mamíferos Wide-Field Microscopía

Labeling Stem Cells with Fluorescent Dyes for non-invasive Detection with Optical Imaging

Etiquetado de las células madre con tintes fluorescentes para la detección no invasiva con imágenes ópticas

Optical imaging (OI) is an easy, fast and inexpensive tool for in vivo monitoring of new stem cell based therapies. The technique is based on ex vivo ...

Fluorescence-based Measurement of Store-operated Calcium Entry in Live Cells: from Cultured Cancer Cell to Skeletal Muscle Fiber

Basado en la fluorescencia de medición de la entrada de calcio de la tienda que funciona en las células vivas: a partir de células cancerosas cultivadas de fibra muscular esquelética

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

En Vivo Tracking 4-Dimensional de madre hematopoyéticas y células progenitoras en ratones adultos de calota de Médula Ósea

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Fluorescence Imaging with One-nanometer Accuracy (FIONA)

Fluorescence Imaging with One-nanometer Accuracy FIONA

Imágenes de fluorescencia con un nanómetros Precisión (FIONA)

Fluorescence imaging with one-nanometer accuracy (FIONA) is a simple but useful technique for localizing single fluorophores with nanometer precision in ...

Tandem High-pressure Freezing and Quick Freeze Substitution of Plant Tissues for Transmission Electron Microscopy

Tandem congelación de alta presión y la rápida congelación de sustitución de tejidos vegetales para Microscopía Electrónica de Transmisión

Since the 1940s transmission electron microscopy (TEM) has been providing biologists with ultra-high resolution images of biological materials. Yet, ...

A Graphical User Interface for Software-assisted Tracking of Protein Concentration in Dynamic Cellular Protrusions

Una interfaz gráfica de usuario para el seguimiento asistido por software de la concentración de proteínas en protones dinámicos celulares

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex ...

Imaging FITC-dextran as a Reporter for Regulated Exocytosis

Proyección de imagen de FITC-dextrano como reportero para exocitosis regulada

Regulated exocytosis is a process by which cargo, which is stored in secretory granules (SGs), is released in response to a secretory trigger. Regulated ...

Biological Sample Preparation by High-pressure Freezing, Microwave-assisted Contrast Enhancement, and Minimal Resin Embedding for Volume Imaging

Preparación de muestras biológicas por congelación de alta presión, realce del contraste asistida por microondas y mínima inclusión de proyección de imagen de volumen

The described sample preparation technique is designed to combine the best quality of ultrastructural preservation with the most suitable contrast for the ...