Name: imaging exocytosis in retinal bipolar cells with tirf microscopy
Uploaded: 2009-06-09T00:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Imaging Exocytosis in Retinal Bipolar Cells with TIRF Microscopy at JoVE.com

Detta arbete stöddes av NIH Grant EY 14.990.

Del 1: Dissection och bipolär Cell Isolation <ol><li> Förbered lösningarna enligt tabell 2, pH ringsignaler &quot;(extern) bör lösningar justeras till 7,4 med NaOH och pH-värdet av den interna lösningen ska justeras till 7,2 med CsOH. Skydda intern lösning från ljus med aluminiumfolie och förvara den i 4 ° C fram till användning; </li><li> Dark-anpassa en guldfisk i minst 30 minuter före dissektion; </li><li> Medan djuret mörka anpassar sig, förbereda 5 ml hyaluronidas (typ V hyaluronidas, 1100 enheter ...

<ol>
	<li>Axelrod, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Total+internal+reflection+fluorescence+microscopy+in+cell+biology.">Total internal reflection fluorescence microscopy in cell biology.</a> Traffic. 2, 764-774 (2001).</li><li>Zenisek, D., Steyer, J. A., Almers, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transport,+capture+and+exocytosis+of+single+synaptic+vesicles+at+active+zones.">Transport, capture and exocytosis of single synaptic vesicles at active zones.</a> Nature. 406, 849-854 (2000).</li><li>Zenisek, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vesicle+association+and+exocytosis+at+ribbon+and+extraribbon+sites+in+retinal+bipolar+cell+presynaptic+terminals.">Vesicle association and exocytosis at ribbon and extraribbon sites in retinal bipolar cell presynaptic terminals.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 105, 4922-4927 (2008).</li><li>Zenisek, D., Horst, N. K., Merrifield, C., Sterling, P., Matthews, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+synaptic+ribbons+in+the+living+cell.">Visualizing synaptic ribbons in the living cell.</a> J. Neurosci. 24, 9752-9759 (2004).</li><li>Axelrod, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+imaging+of+surface+fluorescence+with+very+high+aperture+microscope+objectives.">Selective imaging of surface fluorescence with very high aperture microscope objectives.</a> J. Biomed. Opt. 6, 6-13 (2001).</li><li>Rouze, N. C., Schwartz, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Continous+and+transient+vesicle+cycling+at+a+ribbon+synapse.">Continous and transient vesicle cycling at a ribbon synapse.</a> J. Neurosci. 18, 8614-8624 (1998).</li></ol>

Fördelarna med objektiv-typ TIRF mikroskopi är att 1) ​​det ger utmärkta optiska sektionering genom att begränsa excitation ljuset till en smal region inom fokalplan målet, vilket minimerar out-of-fokus ljus, 2) eftersom ljuset faller exponentiellt med avståndet kan rörelse i lodrät riktning skall övervakas som en förändring av fluorescensintensiteten, 3) ett effektivt ljus insamling genom höga numeriska bländaröppningen mål 1,5. Den största nackdelen med tekniken är att den är begränsad till avbild...

imaging exocytosis in retinal bipolar cells with tirf microscopy

Total inre reflektans fluorescens (TIRF) mikroskopi är en teknik som gör det möjligt att studera händelser som händer i cellmembranet, genom selektiv avbildning av fluorescerande molekyler som ligger närmast ett högt brytningsindex ämne som glas<sup&gt; 1</sup&gt;. I denna artikel använder vi denna teknik för att bilden exocytos av synaptiska blåsor i näthinnans bipolära celler som isolerats från guldfisk näthinnan. Dessa nervceller är mycket lämpliga för denna typ av studie på grund av deras stora Axon terminaler. Genom att samtidigt patch fastspänning den bipolära celler är det möjligt att undersöka sambandet mellan presynaptisk spänning och synaptic släpp<sup&gt; 2,3</sup&gt;. Synaptic blåsor inuti bipolära cellen terminaler är laddade med en fluorescerande färg (FM 1-43 ®) vid samtidig pusta färgen och en ringsignal lösning som innehåller en hög K<sup&gt; +</sup&gt; Koncentration på den synaptiska terminaler. Detta depolarizes cellerna och stimulerar endocytos och därav färgen upptag i glutamaterg blåsor. Efter tvättning av överflödig färg bort för cirka 30 minuter, celler är redo för att vara lapp fastklämd och avbildat samtidigt med en 488 nm laser. Plåstret pipett Lösningen innehåller en Rhodamine-baserade peptid som binder selektivt till det synaptiska bandet proteinet Ribeye<sup&gt; 4</sup&gt;, Och därigenom märkning band speciellt när terminaler är avbildade med en 561 nm laser. Detta gör den exakta lokaliseringen av aktiva zoner och separation av synaptiska från extra-synaptiska händelser.

Watch this Scientific Journal Video about Imaging Exocytosis in Retinal Bipolar Cells with TIRF Microscopy at JoVE.com

Imaging Exocytosis in Retinal Bipolar Cells with TIRF Microscopy

I denna video visar vi hur du kan märka och visualisera enda synaptiska vesikler exocytos och handel med guldfiskar retinal bipolära celler med total inre reflektans fluorescens (TIRF) mikroskopi.

Imaging exocytos i näthinnan bipolär Celler med TIRF Mikroskopi

Total internal reflectance fluorescence (TIRF) microscopy is a technique that allows the study of events happening at the cell membrane, by selective ...

Research

JoVE Journal

Biology

Measuring Exocytosis in Neurons Using FM Labeling

Mätning exocytos i de nervceller Använda FM-märkning

The ability to measure the kinetics of vesicle release can help provide insight into some of the basics of neurotransmission.  Here we used real-time ...

Long-term Imaging Mammalian Cells using Wide-Field Microscopy

Långsiktiga Imaging däggdjursceller med Wide-området mikroskopi

Labeling Stem Cells with Fluorescent Dyes for non-invasive Detection with Optical Imaging

Märkning stamceller med fluorescerande färger för icke-invasiv Detection med optisk avbildning

Optical imaging (OI) is an easy, fast and inexpensive tool for in vivo monitoring of new stem cell based therapies. The technique is based on ex vivo ...

Fluorescence-based Measurement of Store-operated Calcium Entry in Live Cells: from Cultured Cancer Cell to Skeletal Muscle Fiber

Fluorescens-baserad Mätning av Store-drivs kalcium Entry i levande celler: från odlade Cancer Cell till skelettmuskulatur Fiber

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

In Vivo 4-Dimensional Spårning av Hematopoietic Stem och stamceller i vuxen mus calvarial Benmärg

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Fluorescence Imaging with One-nanometer Accuracy (FIONA)

Fluorescence Imaging with One-nanometer Accuracy FIONA

Fluorescens Imaging med One-nanometer Noggrannhet (FIONA)

Fluorescence imaging with one-nanometer accuracy (FIONA) is a simple but useful technique for localizing single fluorophores with nanometer precision in ...

Tandem High-pressure Freezing and Quick Freeze Substitution of Plant Tissues for Transmission Electron Microscopy

Tandem Högtrycks Frysning och Quick Freeze Substitution av växtvävnad för transmissionselektronmikroskopi

Since the 1940s transmission electron microscopy (TEM) has been providing biologists with ultra-high resolution images of biological materials. Yet, ...

A Graphical User Interface for Software-assisted Tracking of Protein Concentration in Dynamic Cellular Protrusions

En grafisk användargränssnitt för programvaruassisterad spårning av proteinkoncentration i dynamiska cellulära protrusioner

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex ...

Imaging FITC-dextran as a Reporter for Regulated Exocytosis

Imaging FITC-dextran som Reporter för reglerade exocytos

Regulated exocytosis is a process by which cargo, which is stored in secretory granules (SGs), is released in response to a secretory trigger. Regulated ...

Biological Sample Preparation by High-pressure Freezing, Microwave-assisted Contrast Enhancement, and Minimal Resin Embedding for Volume Imaging

Biologiska provberedning genom högtrycks frysning, mikrovågsugn-assisted kontrastförbättring, och Minimal harts inbäddning för volym Imaging

The described sample preparation technique is designed to combine the best quality of ultrastructural preservation with the most suitable contrast for the ...