Name: live cell imaging of f-actin dynamics via fluorescent speckle microscopy (fsm)
Uploaded: 2009-08-05T19:00:00
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Le développement de qFSM est financé par le NIH U01 GM06230.

Section 1: Obtention de votre actine marqués par fluorescence pour le FSM Matériel requis: purifier l&#39;actine, fluorophore (Alexa, X-rhodamine recommandé). G-tampon, ultracentrifugeuse <ol><li> Un élément clé de l&#39;acquisition des films FSM bonnes nécessite l&#39;étiquetage adéquat de l&#39;actine (ou d&#39;autres protéines du cytosquelette) avec le fluorophore de votre choix. Nous vous recommandons d&#39;utiliser des fluorophores d&#39;Alexa (488, 568 longueurs d&#3...

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	<li>Waterman-Storer, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+speckle+microscopy+(FSM)+of+microtubules+and+actin+in+living+cells.">Fluorescent speckle microscopy (FSM) of microtubules and actin in living cells.</a> Curr Protoc Cell Biol. Chapter 4, Unit 4.10-Unit 4.10 (2002).</li><li>Ponti, A., Machacek, M., Gupton, S. L., Waterman-Storer, C. M., Danuser, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+distinct+actin+networks+drive+the+protrusion+of+migrating+cells.">Two distinct actin networks drive the protrusion of migrating cells.</a> Science. 305, 1782-1786 (2004).</li><li>Zhang, X. F., Schaefer, A. W., Burnette, D. T., Schoonderwoert, V. T., Forscher, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rho-dependent+contractile+responses+in+the+neuronal+growth+cone+are+independent+of+classical+peripheral+retrograde+actin+flow.">Rho-dependent contractile responses in the neuronal growth cone are independent of classical peripheral retrograde actin flow.</a> Neuron. 40, 931-944 (2003).</li><li>Salmon, W. C., Adams, M. C., Waterman-Storer, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual-wavelength+fluorescent+speckle+microscopy+reveals+coupling+of+microtubule+and+actin+movements+in+migrating+cells.">Dual-wavelength fluorescent speckle microscopy reveals coupling of microtubule and actin movements in migrating cells.</a> J Cell Biol. 158, 31-37 (2002).</li><li>Danuser, G., Waterman-Storer, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+fluorescent+speckle+microscopy+of+cytoskeleton+dynamics.">Quantitative fluorescent speckle microscopy of cytoskeleton dynamics.</a> Annu Rev Biophys Biomol Struct. 35, 361-387 (2006).</li></ol>

Plusieurs facteurs clés sont indispensables pour réussir à obtenir des images de speckle, taches aussi bonne commencent et finissent avec la qualité de votre actine marqués par fluorescence. Un ratio élevé de l&#39;étiquetage de teinture à l&#39;actine monomère, autour de 0,4 à 0,7 veillera à ce que taches apparaissent lumineux et discret, tandis que la protéine marquée elle-même doit être soluble et libre de granulats. Tout aussi importante est la procédure la microinjection. Pour assurer l&#39;homéos...

Injection de tampon (IB) 50 mM de glutamate de potassium 0,5 M de MgCl2 (annexe 2A) Stockez jusqu&#39;à 2 ans à -20 ° C &nbsp; G-buffer 2 mM de Tris Cl ⋅, pH 8,0 (annexe 2A) 0,2 mM CaCl2 (annexe 2A) Ajouter juste avant utilisation: 0,2 mM d&#39;ATP (voir recette de 100 mM) 0,5 mM de 2-mercaptoéthanol Stockez jusqu&#39;à 1 jour à 4 ° C

live cell imaging of f-actin dynamics via fluorescent speckle microscopy (fsm)

Dans ce protocole, nous décrivons l&#39;utilisation de la microscopie fluorescente chatoiement (FSM) pour capturer des images haute résolution de la dynamique de l&#39;actine dans les cellules PtK1. Un avantage unique de la FSM est sa capacité à capturer le mouvement et la cinétique chiffre d&#39;affaires (montage / démontage) du réseau de la F-actine dans les cellules vivantes. Cette technique est particulièrement utile dans découlant des mesures quantitatives de F-actine dynamiques quand il est associé avec le logiciel de vision par ordinateur (qFSM). Nous décrivons la sélection, la micro-injection et la visualisation des sondes fluorescentes actine dans les cellules vivantes. Surtout, des procédures similaires sont applicables aux assemblées macomolecular visualisant les autres. FSM a été démontrée pour les microtubules, filaments intermédiaires, et des complexes d&#39;adhérence.

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Live Cell Imaging of F-actin Dynamics via Fluorescent Speckle Microscopy FSM

Sélection, la microinjection, et l&#39;imagerie de fluorescence étiqueté F-actine fluorescente via chatoiement de microscopie (FSM).

Imagerie de cellules vivantes de la F-actine fluorescente Dynamics via chatoiement de microscopie (FSM)

In this protocol we describe the use of Fluorescent Speckle Microscopy (FSM) to capture high-resolution images of actin dynamics in PtK1 cells. A unique ...

Research

JoVE Journal

Biology

Live Cell Imaging of F-actin Dynamics via Fluorescent Speckle Microscopy (FSM)

Actin Co-Sedimentation Assay; for the Analysis of Protein Binding to F-Actin

Co-actine sédimentation Assay; pour l&#39;analyse des Binding Protein à F-actine

The actin cytoskeleton within the cell is a network of actin filaments that allows the movement of cells and cellular processes, and that generates ...

Recherche

Biologie

Assembly, Loading, and Alignment of an Analytical Ultracentrifuge Sample Cell

Assemblée, de chargement, et l&#39;alignement d&#39;une cellule échantillon ultracentrifugation analytique

The analytical ultracentrifuge (AUC) is a powerful biophysical tool that allows us to record macromolecular sedimentation profiles during high speed ...

Fluorescent Labeling of COS-7 Expressing SNAP-tag Fusion Proteins for Live Cell Imaging

Marquage fluorescent du COS-7 exprimant des protéines de fusion SNAP-tag pour imagerie de cellules vivantes

SNAP-tag and CLIP-tag protein labeling systems enable the specific, covalent attachment of molecules, including fluorescent dyes, to a protein of interest ...

Fluorescence-based Measurement of Store-operated Calcium Entry in Live Cells: from Cultured Cancer Cell to Skeletal Muscle Fiber

Basées sur la fluorescence de mesure de l&#39;entrée du calcium magasin fonctionnant dans des cellules vivantes: à partir de cellules cancéreuses en culture de fibre musculaire squelettique

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to ...

Intravital Microscopy for Imaging Subcellular Structures in Live Mice Expressing Fluorescent Proteins

Microscopie intravitale pour l&#39;imagerie Subcellular ouvrages chez des souris vivantes exprimant des protéines fluorescentes

Here we describe a procedure to image subcellular structures in live rodents that is based on the use of confocal intravital microscopy. As a model organ, ...

Real-time Imaging of Plant Cell Surface Dynamics with Variable-angle Epifluorescence Microscopy

Imagerie en temps réel des plantes Dynamics de surface cellulaire avec angle variable épifluorescence Microscopie

A plant&#8217;s cell surface is its interface for perceiving environmental cues; it responds with cell biological changes such as membrane trafficking and ...

Three-dimensional Super Resolution Microscopy of F-actin Filaments by Interferometric PhotoActivated Localization Microscopy (iPALM)

Three-dimensional Super Resolution Microscopy of F-actin Filaments by Interferometric PhotoActivated Localization Microscopy iPALM

Trois dimensions Super Resolution Microscopie de Filaments F-actine par interférométrique photoactive Localisation Microscopy (iPALM)

Fluorescence microscopy enables direct visualization of specific biomolecules within cells. However, for conventional fluorescence microscopy, the spatial ...

Exploiting Live Imaging to Track Nuclei During Myoblast Differentiation and Fusion

Exploitant imagerie direct aux noyaux de piste au cours de la différenciation des myoblastes et Fusion

Nuclear positioning within cells is important for multiple cellular processes in development and regeneration. The most intriguing example of nuclear ...

Examination of Mitotic and Meiotic Fission Yeast Nuclear Dynamics by Fluorescence Live-cell Microscopy

Examen de la dynamique nucléaire de levure de fission mitotique et méiotique par fluorescence Microscopie à cellules vivantes

Live-cell imaging is a microscopy technique used to examine cell and protein dynamics in living cells. This imaging method is not toxic, generally does ...

Live Cell Imaging to Assess the Dynamics of Metaphase Timing and Cell Fate Following Mitotic Spindle Perturbations

Imagerie cellulaire en direct pour évaluer la dynamique du moment de la métaphase et le destin cellulaire à la suite de perturbations mitotiques spindle

Live cell time-lapse imaging is an important tool in cell biology that provides insight into cellular processes that might otherwise be overlooked, ...