Name: live cell imaging of f-actin dynamics via fluorescent speckle microscopy (fsm)
Uploaded: 2009-08-05T19:00:00
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O desenvolvimento de qFSM é financiado pelo NIH a concessão U01 GM06230.

Seção 1: Obtenção do seu actina fluorescente etiquetado para FSM Materiais necessários: purificada actina, fluoróforo (Alexa, X-rodamina recomendado). G-buffer, ultracentrífuga <ol><li> Um componente chave para a aquisição de filmes FSM boa exige a rotulagem adequada de actina (ou outras proteínas do citoesqueleto) com o fluoróforo de sua escolha. Recomendamos o uso de fluoróforos Alexa (488, 568 comprimentos de onda) e X-rodamina derivados de éster succinimidyl que a m...

<ol>
	<li>Waterman-Storer, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+speckle+microscopy+(FSM)+of+microtubules+and+actin+in+living+cells.">Fluorescent speckle microscopy (FSM) of microtubules and actin in living cells.</a> Curr Protoc Cell Biol. Chapter 4, Unit 4.10-Unit 4.10 (2002).</li><li>Ponti, A., Machacek, M., Gupton, S. L., Waterman-Storer, C. M., Danuser, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+distinct+actin+networks+drive+the+protrusion+of+migrating+cells.">Two distinct actin networks drive the protrusion of migrating cells.</a> Science. 305, 1782-1786 (2004).</li><li>Zhang, X. F., Schaefer, A. W., Burnette, D. T., Schoonderwoert, V. T., Forscher, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rho-dependent+contractile+responses+in+the+neuronal+growth+cone+are+independent+of+classical+peripheral+retrograde+actin+flow.">Rho-dependent contractile responses in the neuronal growth cone are independent of classical peripheral retrograde actin flow.</a> Neuron. 40, 931-944 (2003).</li><li>Salmon, W. C., Adams, M. C., Waterman-Storer, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual-wavelength+fluorescent+speckle+microscopy+reveals+coupling+of+microtubule+and+actin+movements+in+migrating+cells.">Dual-wavelength fluorescent speckle microscopy reveals coupling of microtubule and actin movements in migrating cells.</a> J Cell Biol. 158, 31-37 (2002).</li><li>Danuser, G., Waterman-Storer, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+fluorescent+speckle+microscopy+of+cytoskeleton+dynamics.">Quantitative fluorescent speckle microscopy of cytoskeleton dynamics.</a> Annu Rev Biophys Biomol Struct. 35, 361-387 (2006).</li></ol>

Vários fatores importantes são cruciais para o êxito da obtenção de imagens speckle, manchas no entanto bom começar e terminar com a qualidade do seu actina fluorescente etiquetado. A relação de rotulagem elevado de tintura para actina monômero, situado em torno de 0,4-,7 irá garantir que os salpicos aparecerá brilhante e discreta, enquanto a proteína em si deve ser rotulado solúvel e livre de agregados. Igualmente importante é o procedimento de microinjeção. Para garantir a homeostase celular normal (e ...

Injeção de buffer (IB) 50 mM glutamato de potássio 0,5 M MgCl2 (ANEXO 2A) Armazenar até 2 anos a -20 ° C &nbsp; G-buffer 2 mM Tris ⋅ Cl, pH 8.0 (Apêndice 2A) 0,2 mM CaCl2 (ANEXO 2A) Adicionar imediatamente antes da utilização: 0,2 mM ATP (ver receita para 100 mM) 0,5 mM 2-mercaptoetanol Armazenar até 1 dia a 4 ° C

live cell imaging of f-actin dynamics via fluorescent speckle microscopy (fsm)

Neste protocolo, descrevemos o uso de Microscopia fluorescente Speckle (FSM) para capturar imagens de alta resolução de actina na dinâmica PtK1 células. A única vantagem do FSM é sua capacidade de captar o movimento e cinética volume de negócios (montagem / desmontagem) da rede de F-actina dentro de células vivas. Esta técnica é particularmente útil em derivar medidas quantitativas de F-actina dinâmica quando emparelhado com o computador de software de visão (qFSM). Descrevemos a seleção microinjeção, e visualização de sondas fluorescentes de actina em células vivas. Importante, procedimentos semelhantes são aplicáveis ​​a visualizar conjuntos macomolecular outros. FSM tem sido demonstrado por microtúbulos, filamentos intermediários, e os complexos de adesão.

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Live Cell Imaging of F-actin Dynamics via Fluorescent Speckle Microscopy FSM

Microinjeção de seleção, e as imagens de fluorescência marcado com F-actina através de microscopia fluorescente speckle (FSM).

Imagens de células vivas de F-actina Dynamics via Microscopia fluorescente Speckle (FSM)

In this protocol we describe the use of Fluorescent Speckle Microscopy (FSM) to capture high-resolution images of actin dynamics in PtK1 cells. A unique ...

Research

JoVE Journal

Biology

Live Cell Imaging of F-actin Dynamics via Fluorescent Speckle Microscopy (FSM)

Actin Co-Sedimentation Assay; for the Analysis of Protein Binding to F-Actin

Actina Ensaio Co Sedimentação; para a Análise da proteína de ligação a F-Actina

The actin cytoskeleton within the cell is a network of actin filaments that allows the movement of cells and cellular processes, and that generates ...

Biologia

Assembly, Loading, and Alignment of an Analytical Ultracentrifuge Sample Cell

Montagem, de carga, e alinhamento de uma célula Analytical ultracentrífuga Amostra

The analytical ultracentrifuge (AUC) is a powerful biophysical tool that allows us to record macromolecular sedimentation profiles during high speed ...

Fluorescent Labeling of COS-7 Expressing SNAP-tag Fusion Proteins for Live Cell Imaging

Labeling fluorescentes de COS-7 expressando as proteínas SNAP tag-Fusion para imagens de células vivas

SNAP-tag and CLIP-tag protein labeling systems enable the specific, covalent attachment of molecules, including fluorescent dyes, to a protein of interest ...

Fluorescence-based Measurement of Store-operated Calcium Entry in Live Cells: from Cultured Cancer Cell to Skeletal Muscle Fiber

Fluorescência baseada em Medição da loja operada entrada de cálcio em células vivas: a partir de células cancerosas cultivadas em fibra muscular esquelética

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to ...

Intravital Microscopy for Imaging Subcellular Structures in Live Mice Expressing Fluorescent Proteins

Microscopia intravital para Estruturas de imagem Subcelulares em ratos vivos Expressando fluorescentes Proteínas

Here we describe a procedure to image subcellular structures in live rodents that is based on the use of confocal intravital microscopy. As a model organ, ...

Real-time Imaging of Plant Cell Surface Dynamics with Variable-angle Epifluorescence Microscopy

Imagens em tempo real de plantas Dynamics da superfície celular com variável de ângulo epifluorescência Microscopia

A plant&#8217;s cell surface is its interface for perceiving environmental cues; it responds with cell biological changes such as membrane trafficking and ...

Three-dimensional Super Resolution Microscopy of F-actin Filaments by Interferometric PhotoActivated Localization Microscopy (iPALM)

Three-dimensional Super Resolution Microscopy of F-actin Filaments by Interferometric PhotoActivated Localization Microscopy iPALM

Tridimensional Super Resolution Microscopia de filamentos de actina F por Interferometric fotoativado Localization Microscopy (iPALM)

Fluorescence microscopy enables direct visualization of specific biomolecules within cells. However, for conventional fluorescence microscopy, the spatial ...

Exploiting Live Imaging to Track Nuclei During Myoblast Differentiation and Fusion

Explorando a imagem ao vivo aos núcleos de pista durante a diferenciação de Myoblast e fusão

Nuclear positioning within cells is important for multiple cellular processes in development and regeneration. The most intriguing example of nuclear ...

Examination of Mitotic and Meiotic Fission Yeast Nuclear Dynamics by Fluorescence Live-cell Microscopy

Examinação da dinâmica nuclear do fermento mitotic e Meiotic da fissão pela microscopia viva-pilha da fluorescência

Live-cell imaging is a microscopy technique used to examine cell and protein dynamics in living cells. This imaging method is not toxic, generally does ...

Live Cell Imaging to Assess the Dynamics of Metaphase Timing and Cell Fate Following Mitotic Spindle Perturbations

Imagem latente viva da pilha para avaliar a dinâmica do sincronismo da metafase e do Fate da pilha depois das perturbações mitotic do eixo

Live cell time-lapse imaging is an important tool in cell biology that provides insight into cellular processes that might otherwise be overlooked, ...