Name: live cell imaging of f-actin dynamics via fluorescent speckle microscopy (fsm)
Uploaded: 2009-08-05T19:00:00
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El desarrollo de qFSM es financiado por el NIH subvención GM06230 U01.

Sección 1: La obtención de la etiqueta fluorescente para actina FSM Materiales necesarios: purificada actina, fluoróforo (Alexa, X-rodamina recomendado). G-buffer, ultracentrífuga <ol><li> Un componente clave para la adquisición de buenas películas FSM exige el correcto etiquetado de actina (u otras proteínas del citoesqueleto), con el fluoróforo de su elección. Se recomienda el uso de fluoróforos Alexa (488, 568 longitudes de onda) y X-rodamina derivados de éster de succ...

<ol>
	<li>Waterman-Storer, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+speckle+microscopy+(FSM)+of+microtubules+and+actin+in+living+cells.">Fluorescent speckle microscopy (FSM) of microtubules and actin in living cells.</a> Curr Protoc Cell Biol. Chapter 4, Unit 4.10-Unit 4.10 (2002).</li><li>Ponti, A., Machacek, M., Gupton, S. L., Waterman-Storer, C. M., Danuser, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+distinct+actin+networks+drive+the+protrusion+of+migrating+cells.">Two distinct actin networks drive the protrusion of migrating cells.</a> Science. 305, 1782-1786 (2004).</li><li>Zhang, X. F., Schaefer, A. W., Burnette, D. T., Schoonderwoert, V. T., Forscher, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rho-dependent+contractile+responses+in+the+neuronal+growth+cone+are+independent+of+classical+peripheral+retrograde+actin+flow.">Rho-dependent contractile responses in the neuronal growth cone are independent of classical peripheral retrograde actin flow.</a> Neuron. 40, 931-944 (2003).</li><li>Salmon, W. C., Adams, M. C., Waterman-Storer, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual-wavelength+fluorescent+speckle+microscopy+reveals+coupling+of+microtubule+and+actin+movements+in+migrating+cells.">Dual-wavelength fluorescent speckle microscopy reveals coupling of microtubule and actin movements in migrating cells.</a> J Cell Biol. 158, 31-37 (2002).</li><li>Danuser, G., Waterman-Storer, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+fluorescent+speckle+microscopy+of+cytoskeleton+dynamics.">Quantitative fluorescent speckle microscopy of cytoskeleton dynamics.</a> Annu Rev Biophys Biomol Struct. 35, 361-387 (2006).</li></ol>

Varios factores clave son cruciales para el éxito de la obtención de imágenes de manchas, manchas por bueno comenzar y terminar con la calidad de la actina marcados con fluorescencia. Una proporción alta de etiquetado de tinte a la actina monómero, en torno a 0,4 a 0,7 se asegurará de que van a aparecer manchas brillantes y discreto, mientras que la proteína marcada en sí debe ser soluble y libre de los agregados. Igualmente importante es el procedimiento de microinyección. Para asegurar la homeostasis celular ...

Inyección de tampón (IB) 50 mM de glutamato de potasio 0,5 M MgCl2 (Anexo 2a) Almacenar hasta 2 años a -20 ° C &nbsp; G-buffer 2 mM Tris ⋅ Cl, pH 8.0 (Anexo 2a) 0.2 mM CaCl2 (Anexo 2a) Añadir justo antes del uso: 0,2 mM ATP (ver receta a 100 mM) 0,5 mM 2-mercaptoetanol Almacenar hasta 1 día a 4 ° C

live cell imaging of f-actin dynamics via fluorescent speckle microscopy (fsm)

En este protocolo se describe el uso de fluorescentes Speckle Microscopía (FSM) para capturar imágenes de alta resolución de la dinámica de actina en las células PtK1. Una ventaja única del FSM es su capacidad para captar el movimiento y la cinética de rotación (armado / desarmado) de la red de F-actina en las células vivas. Esta técnica es particularmente útil en la obtención de mediciones cuantitativas de la dinámica de actina F-cuando se combina con el software de visión por computador (qFSM). Se describe la selección, la microinyección y la visualización de las sondas fluorescentes de actina en las células vivas. Es importante destacar que procedimientos similares se aplican a la visualización de las otras asambleas macomolecular. FSM ha sido demostrada para los microtúbulos, filamentos intermedios y los complejos de adhesión.

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Live Cell Imaging of F-actin Dynamics via Fluorescent Speckle Microscopy FSM

Selección, la microinyección, y las imágenes de fluorescencia marcado con F-actina a través de microscopía de fluorescencia moteado (FSM).

Imágenes de células vivas de la F-actina Dynamics a través de Microscopía Fluorescente Speckle (FSM)

In this protocol we describe the use of Fluorescent Speckle Microscopy (FSM) to capture high-resolution images of actin dynamics in PtK1 cells. A unique ...

Research

JoVE Journal

Biology

Live Cell Imaging of F-actin Dynamics via Fluorescent Speckle Microscopy (FSM)

Actin Co-Sedimentation Assay; for the Analysis of Protein Binding to F-Actin

Actina Co-sedimentación de ensayo, pues el análisis de proteína de unión a la F-actina

The actin cytoskeleton within the cell is a network of actin filaments that allows the movement of cells and cellular processes, and that generates ...

Investigación

Biología

Assembly, Loading, and Alignment of an Analytical Ultracentrifuge Sample Cell

Concentración, la carga, y la alineación de una célula de ultracentrifugación analítica de muestras

The analytical ultracentrifuge (AUC) is a powerful biophysical tool that allows us to record macromolecular sedimentation profiles during high speed ...

Fluorescent Labeling of COS-7 Expressing SNAP-tag Fusion Proteins for Live Cell Imaging

Marcaje fluorescente de COS-7 Expresando etiqueta SNAP-proteínas de fusión de imágenes de células vivas

SNAP-tag and CLIP-tag protein labeling systems enable the specific, covalent attachment of molecules, including fluorescent dyes, to a protein of interest ...

Fluorescence-based Measurement of Store-operated Calcium Entry in Live Cells: from Cultured Cancer Cell to Skeletal Muscle Fiber

Basado en la fluorescencia de medición de la entrada de calcio de la tienda que funciona en las células vivas: a partir de células cancerosas cultivadas de fibra muscular esquelética

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to ...

Intravital Microscopy for Imaging Subcellular Structures in Live Mice Expressing Fluorescent Proteins

Microscopia intravital para formar imágenes de estructuras subcelulares en ratones vivos que expresan proteínas fluorescentes

Here we describe a procedure to image subcellular structures in live rodents that is based on the use of confocal intravital microscopy. As a model organ, ...

Real-time Imaging of Plant Cell Surface Dynamics with Variable-angle Epifluorescence Microscopy

Imágenes en tiempo real de la Planta Dinámica superficie celular con Variable de ángulo epifluorescencia Microscopía

A plant&#8217;s cell surface is its interface for perceiving environmental cues; it responds with cell biological changes such as membrane trafficking and ...

Three-dimensional Super Resolution Microscopy of F-actin Filaments by Interferometric PhotoActivated Localization Microscopy (iPALM)

Three-dimensional Super Resolution Microscopy of F-actin Filaments by Interferometric PhotoActivated Localization Microscopy iPALM

Tridimensional súper resolución Microscopía de filamentos de actina F por interferométrica photoactivated localización de Microscopía (iPalm)

Fluorescence microscopy enables direct visualization of specific biomolecules within cells. However, for conventional fluorescence microscopy, the spatial ...

Exploiting Live Imaging to Track Nuclei During Myoblast Differentiation and Fusion

Explotando en la proyección de imagen a los núcleos de la pista durante la fusión y diferenciación de mioblastos

Nuclear positioning within cells is important for multiple cellular processes in development and regeneration. The most intriguing example of nuclear ...

Examination of Mitotic and Meiotic Fission Yeast Nuclear Dynamics by Fluorescence Live-cell Microscopy

Examen de la dinámica nuclear de levadura de ficción mitotica y meiótica por microscopía de células vivas de fluorescencia

Live-cell imaging is a microscopy technique used to examine cell and protein dynamics in living cells. This imaging method is not toxic, generally does ...

Live Cell Imaging to Assess the Dynamics of Metaphase Timing and Cell Fate Following Mitotic Spindle Perturbations

Imágenes de células vivas para evaluar la dinámica del tiempo metafásico y el destino celular después de las perturbaciones del husillo mitático

Live cell time-lapse imaging is an important tool in cell biology that provides insight into cellular processes that might otherwise be overlooked, ...