Name: live cell imaging of f-actin dynamics via fluorescent speckle microscopy (fsm)
Uploaded: 2009-08-05T19:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Live Cell Imaging of F-actin Dynamics via Fluorescent Speckle Microscopy FSM at JoVE.com

Utvecklingen av qFSM finansieras av NIH bidraget U01 GM06230.

Avsnitt 1: få din fluorescerande aktin för FSM Material som behövs: renat aktin, fluoroforen (Alexa, X-Rhodamine rekommenderas). G-buffert, ultracentrifugen <ol><li> En viktig komponent för att skaffa bra Mikronesiens filmer kräver korrekt märkning av aktin (eller andra cytoskelettala proteiner) med fluoroforen som du väljer. Vi rekommenderar fluoroforer av Alexa (488, 568 våglängder) och X-Rhodamine succinimidyl derivat ester som riktar utsätts lysinrester på ytan av akt...

<ol>
	<li>Waterman-Storer, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+speckle+microscopy+(FSM)+of+microtubules+and+actin+in+living+cells.">Fluorescent speckle microscopy (FSM) of microtubules and actin in living cells.</a> Curr Protoc Cell Biol. Chapter 4, Unit 4.10-Unit 4.10 (2002).</li><li>Ponti, A., Machacek, M., Gupton, S. L., Waterman-Storer, C. M., Danuser, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+distinct+actin+networks+drive+the+protrusion+of+migrating+cells.">Two distinct actin networks drive the protrusion of migrating cells.</a> Science. 305, 1782-1786 (2004).</li><li>Zhang, X. F., Schaefer, A. W., Burnette, D. T., Schoonderwoert, V. T., Forscher, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rho-dependent+contractile+responses+in+the+neuronal+growth+cone+are+independent+of+classical+peripheral+retrograde+actin+flow.">Rho-dependent contractile responses in the neuronal growth cone are independent of classical peripheral retrograde actin flow.</a> Neuron. 40, 931-944 (2003).</li><li>Salmon, W. C., Adams, M. C., Waterman-Storer, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual-wavelength+fluorescent+speckle+microscopy+reveals+coupling+of+microtubule+and+actin+movements+in+migrating+cells.">Dual-wavelength fluorescent speckle microscopy reveals coupling of microtubule and actin movements in migrating cells.</a> J Cell Biol. 158, 31-37 (2002).</li><li>Danuser, G., Waterman-Storer, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+fluorescent+speckle+microscopy+of+cytoskeleton+dynamics.">Quantitative fluorescent speckle microscopy of cytoskeleton dynamics.</a> Annu Rev Biophys Biomol Struct. 35, 361-387 (2006).</li></ol>

Flera viktiga faktorer är avgörande för att lyckas få speckle bilder, hur bra prickar börjar och slutar med kvaliteten på din fluorescerande aktin. En hög märkning förhållande färgämne till aktin monomer, ligger runt 0,4 till 0,7 kommer att säkerställa att fläckarna kommer att visas ljusa och diskreta, medan de märkta proteinet i sig bör vara lösliga och fri från aggregat. Lika viktigt är mikroinjektion förfarande. För att säkerställa normal cell homeostas (och överlevnad), celler måste injicer...

Injektion buffert (IB) 50 mM kalium glutamat 0,5 M MgCl2 (BILAGA 2A) Lagra upp till 2 år vid -20 ° C &nbsp; G-buffert 2 mM Tris ⋅ Cl, pH 8,0 (BILAGA 2A) 0,2 mM CaCl2 (BILAGA 2A) Lägg till strax före användning: 0,2 mM ATP (se recept på 100 mm) 0,5 mm 2-merkaptoetanol Lagra upp till 1 dygn vid 4 ° C

live cell imaging of f-actin dynamics via fluorescent speckle microscopy (fsm)

I detta protokoll beskriver vi användning av fluorescerande Speckle mikroskopi (FSM) för att ta högupplösta bilder av aktin dynamik i PtK1 celler. En unik fördel med Mikronesiens är dess förmåga att fånga rörelsen och kinetik omsättning (montering / demontering) av F-aktin nätverk inom levande celler. Denna teknik är särskilt användbart med att dra kvantitativa mätningar av F-aktin dynamik när det paras ihop med datorseende programvara (qFSM). Vi beskriver valet, mikroinjektion och visualisering av fluorescerande aktin sonder i levande celler. Viktigt liknande förfaranden gäller för visualisera andra macomolecular församlingar. FSM har visats för mikrotubuli, intermediära filament och komplex vidhäftning.

Watch this Scientific Journal Video about Live Cell Imaging of F-actin Dynamics via Fluorescent Speckle Microscopy FSM at JoVE.com

Live Cell Imaging of F-actin Dynamics via Fluorescent Speckle Microscopy FSM

Urval, mikroinjektion och avbildning av fluorescerande-märkta F-aktin via fluorescerande speckle mikroskopi (FSM).

Levande cell imaging av F-aktin Dynamics via Fluorescent Speckle Mikroskopi (FSM)

In this protocol we describe the use of Fluorescent Speckle Microscopy (FSM) to capture high-resolution images of actin dynamics in PtK1 cells. A unique ...

Research

JoVE Journal

Biology

Live Cell Imaging of F-actin Dynamics via Fluorescent Speckle Microscopy (FSM)

Actin Co-Sedimentation Assay; for the Analysis of Protein Binding to F-Actin

Aktin Co-Sedimentering-analys, för analys av proteinbindning till F-Actin

The actin cytoskeleton within the cell is a network of actin filaments that allows the movement of cells and cellular processes, and that generates ...

Assembly, Loading, and Alignment of an Analytical Ultracentrifuge Sample Cell

Montering, lastning och Uppriktning av en analytisk ultracentrifugen Sample Cell

The analytical ultracentrifuge (AUC) is a powerful biophysical tool that allows us to record macromolecular sedimentation profiles during high speed ...

Fluorescent Labeling of COS-7 Expressing SNAP-tag Fusion Proteins for Live Cell Imaging

Fluorescerande märkning av COS-7 uttrycka SNAP-tagg fusionsproteiner för levande cell imaging

SNAP-tag and CLIP-tag protein labeling systems enable the specific, covalent attachment of molecules, including fluorescent dyes, to a protein of interest ...

Fluorescence-based Measurement of Store-operated Calcium Entry in Live Cells: from Cultured Cancer Cell to Skeletal Muscle Fiber

Fluorescens-baserad Mätning av Store-drivs kalcium Entry i levande celler: från odlade Cancer Cell till skelettmuskulatur Fiber

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to ...

Intravital Microscopy for Imaging Subcellular Structures in Live Mice Expressing Fluorescent Proteins

Intravital Mikroskopi för Imaging subcellulära strukturer i levande möss som uttrycker fluorescerande proteiner

Here we describe a procedure to image subcellular structures in live rodents that is based on the use of confocal intravital microscopy. As a model organ, ...

Real-time Imaging of Plant Cell Surface Dynamics with Variable-angle Epifluorescence Microscopy

Realtid avbildning av växtcellytan Dynamisk med variabel vinkel epifluorescensmikroskopi

A plant&#8217;s cell surface is its interface for perceiving environmental cues; it responds with cell biological changes such as membrane trafficking and ...

Three-dimensional Super Resolution Microscopy of F-actin Filaments by Interferometric PhotoActivated Localization Microscopy (iPALM)

Three-dimensional Super Resolution Microscopy of F-actin Filaments by Interferometric PhotoActivated Localization Microscopy iPALM

Tredimensionell Super Resolution mikroskopi av F-aktinfilament av interferometriska photoactivated Lokalisering Microscopy (iPALM)

Fluorescence microscopy enables direct visualization of specific biomolecules within cells. However, for conventional fluorescence microscopy, the spatial ...

Exploiting Live Imaging to Track Nuclei During Myoblast Differentiation and Fusion

Att utnyttja levande Imaging till spår kärnor under gorgina differentiering och Fusion

Nuclear positioning within cells is important for multiple cellular processes in development and regeneration. The most intriguing example of nuclear ...

Examination of Mitotic and Meiotic Fission Yeast Nuclear Dynamics by Fluorescence Live-cell Microscopy

Undersökning av mitotiska och Meiotic fission jäst nukleär dynamik genom fluorescens Live-cell Microscopy

Live-cell imaging is a microscopy technique used to examine cell and protein dynamics in living cells. This imaging method is not toxic, generally does ...

Live Cell Imaging to Assess the Dynamics of Metaphase Timing and Cell Fate Following Mitotic Spindle Perturbations

Live cell Imaging att bedöma dynamiken i metafas timing och cell öde efter mitotiska spindel Perturbations

Live cell time-lapse imaging is an important tool in cell biology that provides insight into cellular processes that might otherwise be overlooked, ...