Name: in utero and ex vivo electroporation for gene expression in mouse retinal ganglion cells
Uploaded: 2009-09-24T15:00:00
Duration: 25 min 6 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about In utero and ex vivo Electroporation for Gene Expression in Mouse Retinal Ganglion Cells at JoVE.com

Wij danken dr. Richard Vallee en Brikha Shrestha voor hulp bij de in utero en ex vivo netvlies elektroporatie technieken, respectievelijk, en dr. T. Sakurai voor reacties op dit protocol. Dit werk werd ondersteund door National Institutes of Health subsidies F31 NS051008 (TJP), de Fondation pour la Recherche Medicale, en het Human Frontier Science Program (AR) en R01 EY12736 (CM).

<ol>
	<li>Chalupa, L. M., Williams, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Eye Retina and the Visual Systems of the Mouse. , (2008).</li><li>Matsuda, T., Cepko, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroporation+and+RNA+interference+in+the+rodent+retina+in+vivo+and+in+vitro.">Electroporation and RNA interference in the rodent retina in vivo and in vitro.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 16-22 (2004).</li><li>Ishikawa, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+GDNF+gene+transfer+into+axotomized+retinal+ganglion+cells+using+in+vivo+electroporation+with+a+contact+lens-type+electrode.">Effect of GDNF gene transfer into axotomized retinal ganglion cells using in vivo electroporation with a contact lens-type electrode.</a> Gene Ther. 12, 289-298 (2005).</li><li>Donovan, S. L., Dyer, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+and+square+wave+electroporation+of+retinal+explant+cultures.">Preparation and square wave electroporation of retinal explant cultures.</a> Nat Protoc. 1, 2710-2718 (2006).</li><li>Garcia-Frigola, C., Carreres, M. I., Vegar, C., Herrera, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+delivery+into+mouse+retinal+ganglion+cells+by+in+utero+electroporation.">Gene delivery into mouse retinal ganglion cells by in utero electroporation.</a> BMC Dev Biol. 7, 103-10 (2007).</li><li>Petros, T. J., Shrestha, B. R., Mason, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specificity+and+sufficiency+of+EphB1+in+driving+the+ipsilateral+retinal+projection.">Specificity and sufficiency of EphB1 in driving the ipsilateral retinal projection.</a> J Neurosci. 29, 3463-3474 (2009).</li></ol>

In deze video, hebben we aangetoond elektroporatie technieken, zowel in utero en ex vivo, voor-gen in embryonale muizen RGC. In utero netvlies elektroporatie een mechanisme voor het manipuleren van genexpressie in RGC biedt en visualiseren van hun axon projecties in vivo. Het toestaan ​​van de embryo&#39;s om te overleven postnataal onderzoek van deze GFP + RGC projecties vergunningen in hun doel, de laterale nucleus geniculate (LGN). Ex-vivo-retinal elektroporatie zorgt voor een meer gecontroleerde mogelijkheid om specifieke netvlies regio&#39;s doelstelling voor gebruik met in vitro testen. De combinatie van in vivo en in vitro analyses afgeleid van deze technieken maakt een grondige karakterisering van RGC ontwikkeling en axon projecties in een subset van RGC in een overigens normale achtergrond. Terwijl onze demonstratie richt zich op het RGC axon begeleiding op de optisch chiasma, zowel in utero en ex vivo netvlies electroporations voordelig zou kunnen zijn om te bestuderen hoe verstoringen in genexpressie effect RGC differentiatie, dendritische morfologie, elektrofysiologische eigenschappen, synapsvorming en de juiste targeting in de beëindiging zones zoals als de LGN en superieure colliculus.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>BTX Electro Square Porator ECM 830 (with foot paddle)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Harvard Apparatus</td>
<td>450052</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Round tweezer electrodes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Nepa Gene</td>
<td>CUY650-5 or CUY650-7</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Silk Sutures</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Henry Schein</td>
<td>101-2636</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Glass micropipettes with plungers</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Drummond</td>
<td>5-000-1001-X10</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Antibiototic-antimycotic</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>15240096</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>DMEM/F12 medium</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gibco</td>
<td>11330057</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Albumin bovine serum</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>A8806-5G</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>ITS supplement</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>I-1884</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Penicillin-Streptomycin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>15140-122</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Methyl cellulose</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>M0512</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Glass Bottom Microwell Dishes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>MatTek Corporation</td>
<td>P35G-1.5-14-C</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Poly-L-ornithine</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>P4957</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Laminin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>23017-015</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

in utero and ex vivo electroporation for gene expression in mouse retinal ganglion cells

Het netvlies en zijn enige uitgang neuron, de retinale ganglion cel (RGC), omvatten een uitstekend model, waarin de biologische vragen, zoals celdifferentiatie, axon begeleiding, retinotopische organisatie en synapsvorming [1] te onderzoeken. Een nadeel is het onvermogen om genexpressie efficiënt en betrouwbaar te manipuleren in het RGC in vivo, met name in de anders zo toegankelijk murine visuele zenuwbanen. Transgene muizen kunnen worden gebruikt om genexpressie te manipuleren, maar deze aanpak is vaak duur, tijdrovend, en kan ongewenste bijwerkingen veroorzaken. In chick, is in ovo electroporatie gebruikt om de genexpressie te manipuleren in RGC voor de behandeling van het netvlies en RGC ontwikkeling. Hoewel soortgelijke elektroporatie technieken zijn ontwikkeld in neonatale muis pups [2], volwassen ratten [3], en embryonale muizen retinae in vitro [4], geen van deze strategieën toe volledige karakterisering van RGC ontwikkeling en axonen projecties in vivo. Daartoe hebben we twee toepassingen van elektroporatie, een in utero en de andere ex vivo, specifiek gericht embryonale murine RGC [5, 6]. Met in utero netvlies elektroporatie, kunnen wij misexpress of downregulate specifieke genen in RGC en volg hun axon projecties door de visuele pathways in vivo, waardoor het onderzoek van begeleiding beslissingen op tussendoelen, zoals de optische chiasma, of at target regio&#39;s, zoals de laterale geniculate kern. Storende genexpressie in een subset van RGC in een overigens wild-type achtergrond maakt een begrip van gen-functie in de retina pad. Daarnaast hebben we een metgezel techniek voor het analyseren van RGC axon groei in vitro. We electroporate embryonale hoofden ex vivo, te verzamelen en incubeer het hele netvlies, dan explantaten later voor te bereiden op deze retinae meerdere dagen. Retinale explanten kan gebruikt worden in een verscheidenheid van in vitro tests in om de reactie van geëlektroporeerd RGC axonen te begeleiden signalen of andere factoren te onderzoeken. Kortom, deze set van technieken vergroot ons vermogen om misexpress of genen downregulate in RGC en moet veel hulp studies onderzoeken RGC ontwikkeling en axon projecties.

Watch this Scientific Journal Video about In utero and ex vivo Electroporation for Gene Expression in Mouse Retinal Ganglion Cells at JoVE.com

In utero and ex vivo Electroporation for Gene Expression in Mouse Retinal Ganglion Cells

Hier presenteren wij twee technieken voor het manipuleren van genexpressie in muriene retinale ganglioncellen (RGC) door<em&gt; In utero</em&gt; En<em&gt; Ex vivo</em&gt; Elektroporatie. Deze technieken maken het mogelijk een om te onderzoeken hoe veranderingen in genexpressie RGC ontwikkeling, axon begeleiding en functionele eigenschappen beïnvloeden.

In utero en ex vivo Elektroporatie voor Gene Expression Mouse in retinale ganglioncellen

The retina and its sole output neuron, the retinal ganglion cell (RGC), comprise an excellent model in which to examine biological questions such as cell ...

Research

JoVE Journal

Biology

In utero and ex vivo Electroporation for Gene Expression in Mouse Retinal Ganglion Cells

In Utero Intraventricular Injection and Electroporation of E16 Rat Embryos

In Utero Intraventriculaire injectie en elektroporatie van de E16 Rat embryo&#39;s

In-utero in-vivo injection and electroporation of the embryonic rat neocortex provides a powerful tool for the manipulation of individual progenitors ...

In Utero Intraventricular Injection and Electroporation of E15 Mouse Embryos

In Utero Intraventriculaire injectie en elektroporatie van de E15 muizenembryo&#39;s

In-utero in-vivo injection and electroporation of the embryonic mouse neocortex provides a powerful tool for the manipulation of individual progenitors ...

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

De vervaardiging van primaire hematopoietische cellen culturen uit Murine Bone Marrow voor Elektroporatie

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Using the Gene Pulser MXcell Electroporation System to Transfect Primary Cells with High Efficiency

Met behulp van de Gene Puiser MXcell Elektroporatie systeem om primaire cellen transfecteren met een hoog rendement

Using an Automated Cell Counter to Simplify Gene Expression Studies: siRNA Knockdown of IL-4 Dependent Gene Expression in Namalwa Cells

Met behulp van een geautomatiseerde cel Counter aan Gene Expression Studies Vereenvoudigen: siRNA Knockdown van IL-4 Afhankelijk van genexpressie in cellen Namalwa

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only ...

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

In vitro reconstitutie van de Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more ...

Using SecM Arrest Sequence as a Tool to Isolate Ribosome Bound Polypeptides

Met behulp van SecM Arrestatie sequentie als een Tool om Ribosoom Bound Polypeptiden Isoleer

Extensive research has provided ample evidences suggesting that protein folding in the cell is a co-translational process1-5. However, the exact pathway ...

Gene Transfer into Older Chicken Embryos by ex ovo Electroporation

Gene Transfer into Older Chicken Embryos by ex ovo Electroporation

Gentransfer in Oudere kippenembryo&#39;s door<em&gt; Ex ovo</em&gt; Elektroporatie

The chicken embryo provides an  excellent model system for studying gene function and regulation during  embryonic development. In ovo electroporation is ...

siRNA Screening to Identify Ubiquitin and Ubiquitin-like System Regulators of Biological Pathways in Cultured Mammalian Cells

siRNA Screening naar Ubiquitin en Ubiquitin-achtig systeem regulatoren van biologische pathways identificeren in gekweekte zoogdiercellen

Post-translational modification of proteins with ubiquitin and ubiquitin-like molecules (UBLs) is emerging as a dynamic cellular signaling network that ...

Measurement of Metabolic Rate in Drosophila using Respirometry

Measurement of Metabolic Rate in Drosophila using Respirometry

Meting van Metabolic Rate in<em&gt; Drosophila</em&gt; Gebruik respirometrietest

Metabolic disorders are a frequent problem affecting human health. Therefore, understanding the mechanisms that regulate metabolism is a crucial ...