Name: in utero and ex vivo electroporation for gene expression in mouse retinal ganglion cells
Uploaded: 2009-09-24T15:00:00
Duration: 25 min 6 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about In utero and ex vivo Electroporation for Gene Expression in Mouse Retinal Ganglion Cells at JoVE.com

Ringraziamo il Dr. Richard Vallee e Brikha Shrestha per aiutare con il in utero ed ex tecniche di elettroporazione in vivo della retina, rispettivamente, e il dottor T. Sakurai dei commenti a questo protocollo. Questo lavoro è stato sostenuto dal National Institutes of Borse Salute F31 NS051008 (TJP), la Fondation pour la Recherche Medicale, e lo Human Frontier Science Program (AR) e R01 EY12736 (CM).

<ol>
	<li>Chalupa, L. M., Williams, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Eye Retina and the Visual Systems of the Mouse. , (2008).</li><li>Matsuda, T., Cepko, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroporation+and+RNA+interference+in+the+rodent+retina+in+vivo+and+in+vitro.">Electroporation and RNA interference in the rodent retina in vivo and in vitro.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 16-22 (2004).</li><li>Ishikawa, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+GDNF+gene+transfer+into+axotomized+retinal+ganglion+cells+using+in+vivo+electroporation+with+a+contact+lens-type+electrode.">Effect of GDNF gene transfer into axotomized retinal ganglion cells using in vivo electroporation with a contact lens-type electrode.</a> Gene Ther. 12, 289-298 (2005).</li><li>Donovan, S. L., Dyer, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+and+square+wave+electroporation+of+retinal+explant+cultures.">Preparation and square wave electroporation of retinal explant cultures.</a> Nat Protoc. 1, 2710-2718 (2006).</li><li>Garcia-Frigola, C., Carreres, M. I., Vegar, C., Herrera, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+delivery+into+mouse+retinal+ganglion+cells+by+in+utero+electroporation.">Gene delivery into mouse retinal ganglion cells by in utero electroporation.</a> BMC Dev Biol. 7, 103-10 (2007).</li><li>Petros, T. J., Shrestha, B. R., Mason, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specificity+and+sufficiency+of+EphB1+in+driving+the+ipsilateral+retinal+projection.">Specificity and sufficiency of EphB1 in driving the ipsilateral retinal projection.</a> J Neurosci. 29, 3463-3474 (2009).</li></ol>

In questo video, abbiamo dimostrato tecniche di elettroporazione, sia in utero ed ex vivo, per la consegna gene in embrioni murini RGCs. In utero elettroporazione retina fornisce un meccanismo per la manipolazione dell&#39;espressione genica in RGCs e visualizzare le loro proiezioni degli assoni in vivo. Permettendo gli embrioni permette di sopravvivere dopo la nascita esame di tali GFP + proiezioni RGC nella loro target, il nucleo genicolato laterale (LGN). Ex elettroporazione in vivo della retina fornisce una capacità più controllato a specifici target regioni della retina per l&#39;uso con saggi in vitro. Combinando in vivo e in vitro, analisi derivanti da queste tecniche permette di caratterizzazione approfondita dello sviluppo RGC e proiezioni assonale in un sottogruppo di RGCs in un contesto altrimenti normale. Mentre la nostra manifestazione si concentra sulla guida RGC assoni a livello del chiasma ottico, sia in utero ed ex electroporations vivo della retina potrebbe essere utile per studiare come perturbazioni nella differenziazione effetto espressione genica RGC, morfologia dendritiche, le proprietà elettrofisiologiche, formazione di sinapsi e propria targeting nelle zone di tale risoluzione come LGN e collicolo superiore.

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		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>BTX Electro Square Porator ECM 830 (with foot paddle)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Harvard Apparatus</td>
<td>450052</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Round tweezer electrodes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Nepa Gene</td>
<td>CUY650-5 or CUY650-7</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Silk Sutures</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Henry Schein</td>
<td>101-2636</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Glass micropipettes with plungers</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Drummond</td>
<td>5-000-1001-X10</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Antibiototic-antimycotic</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>15240096</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>DMEM/F12 medium</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gibco</td>
<td>11330057</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Albumin bovine serum</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>A8806-5G</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>ITS supplement</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>I-1884</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Penicillin-Streptomycin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>15140-122</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Methyl cellulose</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>M0512</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Glass Bottom Microwell Dishes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>MatTek Corporation</td>
<td>P35G-1.5-14-C</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Poly-L-ornithine</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>P4957</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Laminin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>23017-015</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

in utero and ex vivo electroporation for gene expression in mouse retinal ganglion cells

La retina e il suo unico neurone di output, le cellule gangliari della retina (RGC), costituiscono un ottimo modello per esaminare questioni biologiche, come la differenziazione cellulare, l&#39;orientamento degli assoni, organizzazione e formazione di sinapsi retinotopica [1]. Uno svantaggio è l&#39;impossibilità di manipolare in modo efficiente e affidabile in RGCs espressione genica in vivo, soprattutto nei percorsi murino altrimenti accessibile visiva. Topi transgenici possono essere utilizzati per manipolare l&#39;espressione genica, ma questo approccio è spesso costoso, richiede tempo, e può produrre effetti collaterali indesiderati. In pulcino, in elettroporazione ovo è usato per manipolare l&#39;espressione genica in RGCs per l&#39;esame della retina e lo sviluppo RGC. Sebbene le tecniche di elettroporazione simili sono state sviluppate in cuccioli di topo neonatale [2], ratti adulti [3], e la retina embrionale murino in vitro [4], nessuna di queste strategie permettono caratterizzazione completa dello sviluppo RGC e proiezioni degli assoni in vivo. A tal fine, abbiamo sviluppato due applicazioni di elettroporazione, una in utero e gli altri ex vivo, in maniera specifica RGCs embrionale murino [5, 6]. Con elettroporazione in utero della retina, possiamo misexpress o downregulate geni specifici in RGCs e seguire le loro proiezioni assone attraverso le vie visive in vivo, che consente l&#39;esame delle decisioni di orientamento a obiettivi intermedi, come il chiasma ottico, o in regioni-obiettivo, come il nucleo genicolato laterale. Perturbante espressione genica in un sottogruppo di RGCs in uno sfondo altrimenti wild-type facilita la comprensione della funzione genica in tutto il percorso della retina. Inoltre, abbiamo sviluppato una tecnica compagno per analizzare la crescita degli assoni RGC in vitro. Noi electroporate embrionale teste ex vivo, raccogliere e incubare la retina intero, quindi preparare espianti di retina in questi giorni più tardi. Espianti di retina può essere utilizzato in una varietà di test in vitro al fine di esaminare la risposta del elettroporate assoni RGC ai segnali di guida o altri fattori. In sintesi, questo insieme di tecniche migliora la nostra capacità di misexpress o downregulate geni RGCs e dovrebbero grande aiuto studi che hanno esaminato lo sviluppo RGC e proiezioni assone.

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In utero and ex vivo Electroporation for Gene Expression in Mouse Retinal Ganglion Cells

Qui vi presentiamo due tecniche per la manipolazione dell&#39;espressione genica nel topo cellule gangliari della retina (RGCs) da<em&gt; In utero</em&gt; E<em&gt; Ex vivo</em&gt; Elettroporazione. Queste tecniche permettono di esaminare come le alterazioni nell&#39;espressione genica influenzano lo sviluppo RGC, l&#39;orientamento degli assoni, e le proprietà funzionali.

In elettroporazione in vivo ed ex utero per l&#39;espressione genica in cellule gangliari della retina del mouse

The retina and its sole output neuron, the retinal ganglion cell (RGC), comprise an excellent model in which to examine biological questions such as cell ...

Research

JoVE Journal

Biology

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L&#39;utilizzo di un contatore automatico cella per semplificare gli studi sull&#39;espressione genica: Knockdown siRNA di IL-4 genica dipendente nelle celle Namalwa

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Il trasferimento genico in embrioni di pollo da anziani<em&gt; Ex ovo</em&gt; Elettroporazione

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