Name: generation of human cd40-activated b cells
Uploaded: 2009-10-16T23:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of Human CD40-activated B cells Video at JoVE.com

<p class="jove_content"> Le protocole pour la génération des cellules B CD40 humains activés à partir des PBMC est divisé en deux parties: la partie A montre la préparation du ligand CD40 exprimant cellules NIH/3T3, qui sera utilisée comme plaque de cellules nourricières lié. Partie B décrit les réelles CD40-B de la culture. </p><p class="jove_title"> A. Préparation de cellules nourricières (tCD40L NIH/3T3) </p><p class="jove_content"> Le NIH/3T3 tCD40L est une adhérente lignée murine de cellules fibroblastes, qui ne devrait jama...

<ol>
	<li>Schultze, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD40-activated+human+B+cells:+an+alternative+source+of+highly+efficient+antigen+presenting+cells+to+generate+autologous+antigen-specific+T+cells+for+adoptive+immunotherapy.">CD40-activated human B cells: an alternative source of highly efficient antigen presenting cells to generate autologous antigen-specific T cells for adoptive immunotherapy.</a> <em style='font-style: italic'>J Clin Invest</em>. <b>100</b>, 2757-2765 (1997).</li><li>Schultze, J. L., Grabbe, S., vonBergwelt-Baildon, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DCs+and+CD40-activated+B+cells:+current+and+future+avenues+to+cellular+cancer+immunotherapy.">DCs and CD40-activated B cells: current and future avenues to cellular cancer immunotherapy.</a> <em style='font-style: italic'>Trends Immunol</em>. <b>25</b>, 659-664 (2004).</li><li>Bergwelt-Baildon, M. v. o. n. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD40-activated+B+cells+express+full+lymph+node+homing+triad+and+induce+T-cell+chemotaxis:+potential+as+cellular+adjuvants.">CD40-activated B cells express full lymph node homing triad and induce T-cell chemotaxis: potential as cellular adjuvants.</a> <em style='font-style: italic'>Blood</em>. <b>107</b>, 2786-2789 (2006).</li><li>Wiesner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conditional+immortalization+of+human+B+cells+by+CD40+ligation.">Conditional immortalization of human B cells by CD40 ligation.</a> <em style='font-style: italic'>PLoS ONE</em>. <b>3</b>, 1464-14 (2008).</li><li>Urashima, M., Chauhan, D., Uchiyama, H., Freeman, G. J., Anderson, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD40+ligand+triggered+interleukin-6+secretion+in+multiple+myeloma.">CD40 ligand triggered interleukin-6 secretion in multiple myeloma.</a> <em style='font-style: italic'>Blood</em>. <b>85</b>, 1903-1912 (1995).</li><li>Lapointe, R., Bellemare-Pelletier, A., Housseau, F., Thibodeau, J., Hwu, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD40-stimulated+B+lymphocytes+pulsed+with+tumor+antigens+are+effective+antigen-presenting+cells+that+can+generate+specific+T+cells.">CD40-stimulated B lymphocytes pulsed with tumor antigens are effective antigen-presenting cells that can generate specific T cells.</a> <em style='font-style: italic'>Cancer Res</em>. <b>63</b>, 2836-2843 (2003).</li><li>von Bergwelt-Baildon, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+primary+and+memory+cytotoxic+T+lymphocyte+responses+are+efficiently+induced+by+means+of+CD40-activated+B+cells+as+antigen-presenting+cells:+potential+for+clinical+application.">Human primary and memory cytotoxic T lymphocyte responses are efficiently induced by means of CD40-activated B cells as antigen-presenting cells: potential for clinical application.</a> <em style='font-style: italic'>Blood</em>. <b>99</b>, 3319-3325 (2002).</li><li>Kondo, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD40-activated+B+cells+can+be+generated+in+high+number+and+purity+in+cancer+patients:+analysis+of+immunogenicity+and+homing+potential.">CD40-activated B cells can be generated in high number and purity in cancer patients: analysis of immunogenicity and homing potential.</a> <em style='font-style: italic'>Clin Exp Immunol</em>. <b>155</b>, 249-256 (2009).</li><li>Mason, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-loaded+CD40-activated+B+cells+stimulate+antigen-specific+T-cell+responses+in+dogs+with+spontaneous+lymphoma.">RNA-loaded CD40-activated B cells stimulate antigen-specific T-cell responses in dogs with spontaneous lymphoma.</a> <em style='font-style: italic'>Gene Ther</em>. <b>15</b>, 955-965 (2008).</li></ol>

<p class="jove_title"> A. Préparation des médias: </p><table border="1"cellspacing="0"><tbody><tr><td colspan="2"> <strong>Cellules nourricières type de support sauvages</strong> </td><td colspan="2"> <strong>Milieu de sélection de cellules Feeder</strong> </td></tr><tr><td> <strong>Réactifs</strong> </td><td> <strong>Concentration</strong> </td><td> <strong>Réactifs</strong> </td><td> <strong>Concentration</strong> </td></tr><tr><td> DMEM-Ham / F12 </td><td></td><td> DMEM-Ham / F12 </td><td></td></tr><tr><td> L-Glutamine </td><td> 365 pg / ml </td><td> L-Glutamine </td><td> 365 pg / ml </td></tr><tr><td> FBS </td><td> 10% </td><td> FBS </td><td> 10% </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> 10 mM </td><td> HEPES </td><td> 10 mM </td></tr><tr><td> Gentamycine </td><td> 15 ug / ml </td><td> Gentamycine </td><td> 15 ug / ml </td></tr><tr><td></td><td></td><td> G-418 </td><td> 0,7 mg / ml </td></tr></table><table cellspacing="0" border="1"><tbody><tr><td colspan="2"> <strong>CD40-B milieu de lavage</strong> </td><td colspan="2"> <strong>CD40-B milieu de culture</strong> </td></tr><tr><td> <strong>Réactifs</strong> </td><td> <strong>Concentration</strong> </td><td> <strong>Réactifs</strong> </td><td> <strong>Concentration</strong> </td></tr><tr></tr></tbody><tbody><tr><td> IMDM </td><td><br /></td><td> IMDM </td><td><br /></td></tr></tbody><tbody><tr><td> L-Glutamine </td><td> 584 pg / ml </td><td> L-Glutamine </td><td> 584 pg / ml </td></tr></tbody><tbody><tr><td> HEPES </td><td> 25 mM </td><td> HEPES </td><td> 25 mM </td></tr></tbody><tbody><tr><td> Gentamycine </td><td> 15 ug / ml </td><td> Gentamycine </td><td> 15 ug / ml </td></tr></tbody><tbody><tr><td><br /></td><td><br /></td><td> rh transferrine </td><td> 50 ug / ml </td></tr></tbody><tbody><tr><td><br /></td><td><br /></td><td> L&#39;insuline rh </td><td> 5 ug / ml </td></tr></tbody><tbody><tr><td><br /></td><td><br /></td><td> AB-Humanserum </td><td> 10% </td></tr></tbody></table><p class="jove_title"> B. Réactifs Divers: </p><table cellspacing="0" border="1"><tbody><tr><td> <strong>Réactifs</strong> </td><td> <strong>Société</strong> </td><td> <strong>Ordonnance n</strong> </td></tr><tr></tr><tr><td> DMEM / Ham F12 </td><td> AAP </td><td> Pas de chat: E15-813 </td></tr><tr><td> IMDM </td><td> Invitrogen Gibco ® </td><td> REF 21980-032 </td></tr><tr><td> Dulbecco PBS (10x) </td><td> AAP </td><td> Cat No H15-011 </td></tr><tr><td> AB-sérum humain </td><td> Invitrogen </td><td> Cat No 34005100 </td></tr><tr><td> holo-transferrine humaine </td><td> Sigma </td><td> Aucun chat T0665 </td></tr><tr><td> Insuline humaine </td><td> Sigma </td><td> Aucun chat I2643 </td></tr><tr><td> Gencin ® </td><td> Sélectionnez Delta </td><td> Art Pas 7395800 </td></tr><tr><td> Interleukine-4 de l&#39;homme </td><td> Immunotools </td><td> Cat No 11130045 </td></tr><tr><td> Cyclosporine A </td><td> Novartis </td><td> Cat No 0078-0109-01 NDC </td></tr><tr><td> FBS </td><td> LONZA </td><td> Aucun chat DE14-802C </td></tr><tr><td> Tampon HEPES </td><td> AAP </td><td> Cat No S11-001 </td></tr><tr><td> G-418 Sulfate </td><td> AAP </td><td> Aucun chat P02-012 </td></tr><tr><td> Trypsine / EDTA (10x) </td><td> Invitrogen Gibco ® </td><td> REF 15400-054 </td></tr></tbody></table><p class="jove_title"> C. Fournitures diverses: </p><table cellspacing="0" border="1"><tbody><tr><td> <strong>Réactifs</strong> </td><td> <strong>Société</strong> </td><td> <strong>Ordonnance n</strong> </td></tr><tr></tr><tr><td> Stérile pipette </td><td> Sarstedt </td><td></td></tr><tr><td> 6-même la plaque </td><td> NUNC </td><td> Cat No 140675 </td></tr><tr><td> 50mL tube conique </td><td> BD Falcon ™ </td><td> Cat No 352070 </td></tr><tr><td> Flacon de culture tissulaire </td><td> SARSTEDT </td><td> Aucun chat 83.1813.002 </td></tr></tbody></table>

generation of human cd40-activated b cells

<p class="jove_content"> CD40-activé des cellules B (CD40-cellules B) ont été identifiés comme une source alternative de l&#39;immuno-stimulation des cellules présentatrices d&#39;antigènes (APC) pour l&#39;immunothérapie du cancer <sup>1-3.</sup> Comparé aux cellules dendritiques (CD), la meilleure APC caractérisée, les cellules CD40-B ont plusieurs propriétés biologiques distinctes et techniques. Similaires aux PED, les cellules B montrent une augmentation de l&#39;expression du CMH et des molécules de co-stimulation (Fig. 1b), présentent une forte capacité migratoire et la présentation des antigènes présents efficacement aux cellules T, après stimulation par un ligand interleukine-4 et CD40 (CD40L). Cependant, contrairement aux CD immatures ou matures, les cellules CD40-B expriment la triade lymphatiques pleine noeud homing composé de CD62L, CCR7/CXCR4, et la fonction des leucocytes antigènes-1 (LFA1, CD11a/CD18), nécessaires à tête chercheuse d&#39;organes lymphoïdes secondaires (Fig.1a) <sup>3.</sup> Cellules CD40-B peuvent être générés sans difficultés à partir de très petites quantités de sang périphérique qui peut être élargi <em>in vitro à</em> de très grandes quantités de très-pur-CD40 des cellules B (&gt; 10 <sup>9</sup> cellules par patient) provenant de donneurs sains ainsi que le cancer patients (Fig.1c, d) <sup>1,4.</sup> </p><p class="jove_content"> Dans ce protocole, nous montrons comment obtenir pleinement activé CD40-B à partir des cellules PBMC humaines. Molécules clés pour la culture cellulaire sont CD40-ligand, l&#39;interleukine-4 (IL-4) et la cyclosporine A. (CSA), qui sont reconstituées dans un cycle de culture de 3-4 jours Aux fins de laboratoire CD40-stimulation est fournie par des cellules exprimant NIH/3T3 humaine recombinante ligand CD40 (tCD40L NIH/3T3) <sup>5.</sup> Pour éviter la contamination par des cellules non transfectées, l&#39;expression du ligand CD40 humaine sur les transfectants doit être vérifié régulièrement (Fig.2). </p><p class="jove_content"> Après 14 jours de CD40-B cultures cellulaires consistent de plus de 95% de cellules B pur et une expansion des cellules CD40-B de plus de 65 jours est souvent possible sans aucune perte de fonction <sup>1, 4.</sup> Cellules CD40-B efficacement relever, traiter et présenter les antigènes aux cellules T <sup>6.</sup> Ils ne sont pas seulement naϊve écoute, mais également d&#39;élargir les cellules T mémoire <sup>7,8.</sup> CD40-activé des cellules B peut être utilisé pour étudier activation des cellules B, la différenciation et la fonction. Par ailleurs, ils représentent un outil prometteur pour la vaccination thérapeutique ou préventive contre les tumeurs <sup>9.</sup> </p>

Watch this Scientific Journal Video about Generation of Human CD40-activated B cells Video at JoVE.com

Generation of Human CD40-activated B cells Video (Video) | JoVE

<p class="jove_content">Dans cette vidéo, nous présentons les<em&gt; Ex vivo</emGénération&gt; et l&#39;expansion des cellules B CD40-activées (CD40-B) à partir de cellules mononucléées du sang périphérique (PBMC) par stimulation par CD40 ligand et l&#39;interleukine-4.</p>

Génération de l&#39;homme CD40-B activés cellules

CD40-activated B cells (CD40-B cells) have been identified as an alternative source of immuno-stimulatory antigen-presenting cells (APC) for cancer ...

Research

JoVE Journal

Biology

Generation of Human CD40-activated B cells

Chromosomal Spread Preparation of Human Embryonic Stem Cells for Karyotyping

Chromosomal Spread Preparation of Human Embryonic Stem Cells for Karyotyping Video (Video) | JoVE

Préparation Étaler chromosomique des cellules souches embryonnaires humaines pour le caryotype

Although human embryonic stem cells (hESC) have been shown to present a stable diploid karyotype 1, many studies have reported that depending on culture ...

Recherche

Biologie

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells by Reprogramming Human Fibroblasts with the Stemgent Human TF Lentivirus Set

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells by Reprogramming Human Fibroblasts with the Stemgent Human TF Lentivirus Set Video (Video) | JoVE

Génération de cellules souches pluripotentes induites par la reprogrammation des fibroblastes humains avec les lentivirus TF Stemgent Homme Set

In 2006, Yamanaka and colleagues first demonstrated that retrovirus-mediated delivery and expression of Oct4, Sox2, c-Myc and Klf4 is capable of inducing ...

Robust Generation of Hepatocyte-like Cells from Human Embryonic Stem Cell Populations

Robust Generation of Hepatocyte-like Cells from Human Embryonic Stem Cell Populations Video (Video) | JoVE

Génération robuste des hépatocytes comme des cellules embryonnaires humaines à partir populations de cellules souches

Despite progress in modelling human drug toxicity, many compounds fail during clinical trials due to unpredicted side effects. The cost of clinical ...

Phenotypic and Functional Characterization of Endothelial Colony Forming Cells Derived from Human Umbilical Cord Blood

Phenotypic and Functional Characterization of Endothelial Colony Forming Cells Derived from Human Umbilical Cord Blood Video (Video) | JoVE

Caractérisation phénotypique et fonctionnelle des cellules endothéliales formant colonie dérivés du sang de cordon ombilical humain

Longstanding views of new blood vessel formation via angiogenesis, vasculogenesis, and arteriogenesis have been recently reviewed1. The presence of ...

Rapid and Efficient Generation of Neurons from Human Pluripotent Stem Cells in a Multititre Plate Format

Rapid and Efficient Generation of Neurons from Human Pluripotent Stem Cells in a Multititre Plate Format Video (Video) | JoVE

Génération rapide et efficace des neurones à partir de cellules souches pluripotentes humaines dans un format plaque Multititre

Existing protocols for the generation of neurons from human pluripotent stem cells (hPSCs) are often tedious in that they are  multistep procedures ...

Generation of Dispersed Presomitic Mesoderm Cell Cultures for Imaging of the Zebrafish Segmentation Clock in Single Cells

Generation of Dispersed Presomitic Mesoderm Cell Cultures for Imaging of the Zebrafish Segmentation Clock in Single Cells Video (Video) | JoVE

Génération d&#39;dispersée présomitique mésoderme cultures cellulaires pour l&#39;imagerie de la segmentation Horloge poisson zèbre dans des cellules individuelles

Segmentation is a  periodic and sequential morphogenetic process in vertebrates. This rhythmic  formation of blocks of tissue called somites along the ...

Generation of Human Cardiomyocytes: A Differentiation Protocol from Feeder-free Human Induced Pluripotent Stem Cells

Generation of Human Cardiomyocytes: A Differentiation Protocol from Feeder-free Human Induced Pluripotent Stem Cells Video (Video) | JoVE

Génération de cardiomyocytes humains: Un protocole de différenciation des induits des cellules souches pluripotentes humaines chargeur sans

In order to investigate the events driving heart development and to determine the molecular mechanisms leading to myocardial diseases in humans, it is ...

Efficient Generation Human Induced Pluripotent Stem Cells from Human Somatic Cells with Sendai-virus

Efficient Generation Human Induced Pluripotent Stem Cells from Human Somatic Cells with Sendai-virus Video (Video) | JoVE

Génération efficace d&#39;origine humaine souches pluripotentes à partir de cellules somatiques humaines avec Sendai-virus

A few years ago, the establishment of human induced pluripotent stem cells (iPSCs) ushered in a new era in biomedicine. Potential uses of human iPSCs ...

Generation and Culture of Blood Outgrowth Endothelial Cells from Human Peripheral Blood

Generation and Culture of Blood Outgrowth Endothelial Cells from Human Peripheral Blood Video (Video) | JoVE

Génération et de la Culture du sang excroissance des cellules endothéliales de sang périphérique humain

Historically, the limited availability of primary endothelial cells from patients with vascular disorders has hindered the study of the molecular ...

High-throughput CRISPR Vector Construction and Characterization of DNA Modifications by Generation of Tomato Hairy Roots

High-throughput CRISPR Vector Construction and Characterization of DNA Modifications by Generation of Tomato Hairy Roots Video (Video) | JoVE

Haut-débit CRISPR Vector Construction et caractérisation de l&#39;ADN Modifications par génération de tomate Poilu Roots

Targeted DNA mutations generated by vectors with clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/Cas9 technology have proven useful for ...