Name: large insert environmental genomic library production
Uploaded: 2009-09-23T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Large Insert Environmental Genomic Library Production at JoVE.com

Мы хотели бы поблагодарить Канадский фонд инноваций, знаний британской Колумбии Фонд развития и Национального наукам и инженерным исследованиям Совета (NSERC) Канады за поддержку проводимых исследований на регионах с низким уровнем кислорода в прибрежных и открытых водах океана. М. Т. и С. были поддержаны стипендии ТУЛА основу финансируемого Центром микробного разнообразия и эволюции (CMDE). МТ также получили стипендии от Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG).

Fosmid библиотеки строительства был разделен на четыре основных этапа и подразделяется на несколько частей (см. рис.1 для обзора). Этап I (см. протокол &quot;экстракции ДНК из 0,22 мкм фильтры Sterivex&quot; [3]) Часть 1: фермент-катализируемых лизиса клеток <p class="jove...

<ol>
	<li>Zaikova, E., Hawley, A., Walsh, D. A., Hallam, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seawater+sampling+and.">Seawater sampling and.</a> J Vis Exp. , (2009).</li><li>Walsh, D. A., Zaikova, E., Hallam, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large+volume+(20L+)+filtration+of+coastal+seawater+samples.">Large volume (20L+) filtration of coastal seawater samples.</a> J Vis Exp. 28, (2009).</li><li>Wright, J. J., Lee, S., Zaikova, E., Walsh, D. A., Hallam, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+Extraction+from+0.22+&#956;M+Sterivex+Filters+and+Cesium+Chloride+Density+Gradient+Centrifugation.">DNA Extraction from 0.22 &#956;M Sterivex Filters and Cesium Chloride Density Gradient Centrifugation.</a> J Vis Exp. 31, 10-3791 (2009).</li><li>Stein, J. L., Marsh, T. L., Wu, K. Y., Shizuya, H., DeLong, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+uncultivated+prokaryotes:+isolation+and+analysis+of+a+40-kilobase-pair+genome+fragment+from+a+planktonic+marine+archaeon.">Characterization of uncultivated prokaryotes: isolation and analysis of a 40-kilobase-pair genome fragment from a planktonic marine archaeon.</a> J. Bacteriol. 178, 591-599 (1996).</li><li>B&#233;j&#224;, O., Suzuki, O., Koonin, M. T., Aravind, E. V., Hadd, L., Nguyen, L. P. A., Villacorta, R., Amjadi, M., Garrigues, C., Jovanovich, S. B., Feldman, R. A., DeLong, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+and+analysis+of+bacterial+artificial+chromosome+libraries+from+a+marine+microbial+assemblage.">Construction and analysis of bacterial artificial chromosome libraries from a marine microbial assemblage.</a> Environ. Microbiol. 2, 516-529 (2000).</li><li>DeLong, E. F., Preston, C. M., Mincer, T., Rich, V., Hallam, S. J., Frigaard, N. -. U., Martinez, A., Sullivan, M. B., Edwards, R., Brito, B. R., Chisholm, S. W., Karl, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Community+genomics+among+stratified+microbial+assemblages+in+the+Ocean's+interior.">Community genomics among stratified microbial assemblages in the Ocean's interior.</a> Science. 311, 496-503 (2006).</li><li>Hallam, S. J., Putnam, N., Preston, C. M., Detter, J. C., Rokhsar, D., Richardson, P. M., DeLong, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reverse+methanogenesis:+testing+the+hypothesis+with+environmental+genomics.">Reverse methanogenesis: testing the hypothesis with environmental genomics.</a> Science. 305, 1457-1462 (2004).</li></ol>

Процедура описана, как наиболее эффективно генерировать большие вставки fosmid библиотека с геномной ДНК, полученных из прибрежных пробы воды. Вверх по течению геномной ДНК добыча описана в отдельном протоколе [3]. Как fosmid-библиотека производство многоступенчатых процесс?...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Step II</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>CopyControl&trade; Fosmid Library Production Kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>EPICENTRE</td>
<td>CCFOS110</td>
<td>sufficient to generate 9-10 fosmid libraries</td>
</tr>
<tr>
<td>SeaPlaque Agarose</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Cambrex</td>
<td>50100</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>stirring hot plate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Corning</td>
<td>PC-420D</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>1.0X TAE running buffer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>CHEF Mapper XA pulsed field electrophoresis system including cooling module and variable speed pump</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Bio-Rad</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>&lambda; DNA-HindIII Digest</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>NEB</td>
<td>N3012S</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>MidRange I PFG Marker</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>NEB</td>
<td>N3551S</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>10,000X SYBR Gold</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>S11494</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>microwavable plastic wrap</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Saran premium wrap</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Safe Imager transilluminator</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>S37102</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>GELase Agarose Gel-Digesting Preparation</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>EPICENTRE</td>
<td>G09100</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>scalpel</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>08-927-5D</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Unit with Ultracel-10 membrane</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Millipore</td>
<td>UFC801024</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Microcon YM-30 Centrifugal Filter Unit </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Millipore</td>
<td>42410</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>nuclease free water</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Ambion</td>
<td>AM9932</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit *2000 assays*#</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>P7589</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>digital dry block heater</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR</td>
<td>12621-088</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>water bath</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR</td>
<td>14231-854</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>centrifuge</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Beckman Coulter</td>
<td>Avanti J-E</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>centrifuge rotor</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Beckman Coulter</td>
<td>JA 5.3</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>table top centrifuge</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Eppendorf</td>
<td>5415D</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>microcentrifuge tubes, 1.7 mL, clear</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Axygen</td>
<td>MCT-175-C</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>15 mL centrifuge tubes </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher-Corning</td>
<td>430052</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Step III</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>LB broth</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>BP 1426-2</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>MgSO4</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>M2643</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>phage dilution buffer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>10 mM Tris-HCl [pH 8.3], 100 mM NaCl, 10 mM MgCl2</td>
</tr>
<tr>
<td>cryogenic vials</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher-Corning</td>
<td>430488</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Step IV</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>96 well plate with lid</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher-Corning</td>
<td>CS003370(3370)</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>384 well plate with lid</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher-Corning</td>
<td>07201157(3680)</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Petri dishes 100 O.D. x 15mm H</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>08-757-12</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Petri dishes 150 Dia. x 15mmH</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>08-757-14</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>BD Falcon BioDish XL 245 X 245 mm</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR</td>
<td>CABD351040</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>glycerol</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>G5516</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>chloramphenicol</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>C0378</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>LB broth</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>BP 1426-2</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Difco Agar</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD</td>
<td>214530</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>glass beads</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>10-310-1</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>QFill3</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Genetix</td>
<td>X3050</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Bleach</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Javex</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Ethanol</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>E7023</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>15 mL centrifuge tubes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher-Corning</td>
<td>430052</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>QPix colony picker</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Genetix</td>
<td>QPix2</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>picking head (E. coli) </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Genetix</td>
<td>X4006</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

large insert environmental genomic library production

Подавляющее большинство микробов в природе в настоящее время остаются недоступными для традиционных методов культивирования. За последние десять лет, культуры, независимых экологических геномной (<em&gt; Т.е.</em&gt; Метагеномных) подходы появились, позволяя исследователям восполнить этот пробел путем культивирования захвата генетического содержания микробных сообществ коренных непосредственно из окружающей среды. С этой целью геномной библиотеки ДНК построены с использованием стандартных хотя и хитрые методы клонирования лаборатории. Здесь мы опишем строительство крупного вставить экологические геномной fosmid библиотека с ДНК происходит от вертикального континуума глубины сезонно гипоксических фьорда. Этот протокол напрямую связана с серией связанных протоколов, включая прибрежные морские отбора проб воды [1], большой объем фильтрации микробной биомассы [2] и выделения ДНК и очистки протокола [3]. Прежде всего, высокая геномной ДНК качество конечного восстановлены с помощью создания 5-фосфорилированных тупыми концами. Конечные отремонтировано ДНК подвергается пульсирующем поле гель-электрофореза (PFGE) для выбора размера и гель добыча осуществляется для восстановления фрагментов ДНК между 30 и 60 тыс. пар оснований (Kb) в длину. Размер выбранного ДНК очищается от матрицы геля PFGE и лигировали фосфатазы обработанных тупого конца fosmid CopyControl вектор pCC1 (ЭПИЦЕНТР<a href="http://www.epibio.com/item.asp?ID=385"&gt; Http://www.epibio.com/item.asp?ID=385</a&gt;). Линейный concatemers из pCC1 и вставьте ДНК впоследствии headfull упакованы в фага лямбда частиц terminase, с последующим заражения фагоустойчивых<em&gt; Е. палочки</em&gt; Клеток. Успешно трансдуцированных клоны будут восстановлены на пластинах LB агар при выборе антибиотика и архивируются в 384-луночного формата пластины с использованием автоматизированных колонии сбор робота (Qpix2, GENETIX). Текущий протокол черпает из различных источников, включая CopyControl Библиотека Fosmid Производство Kit от ЭПИЦЕНТР и опубликованные работы нескольких исследовательских групп [4-7]. Каждый шаг представляется наилучшей практике в уме. По мере возможности мы выделяем тонкости в исполнении для повышения общего качества и эффективности библиотечного производства. Весь процесс производства fosmid библиотеки и автоматизированные сбор колония занимает не менее 7-10 дней, как Есть много шагов инкубации включены. Однако Есть несколько остановочных пунктов возможных, которые упомянуты в протоколе.

Watch this Scientific Journal Video about Large Insert Environmental Genomic Library Production at JoVE.com

Large Insert Environmental Genomic Library Production

Строительство fosmid библиотека с экологическими геномной ДНК, выделенной из вертикального континуума глубины сезонно гипоксических фьорда описано. В результате клон библиотеки собирают в 384-луночных планшетах и ​​архивируются для последующих последовательности и функционального скрининга путем применения автоматизированной системы сбора колонии.

Большой Вставить экологического производства геномной библиотеки

The vast majority of microbes in nature currently remain inaccessible to traditional cultivation methods. Over the past decade, culture-independent ...

Research

JoVE Journal

Biology

Large-Scale Screens of Metagenomic Libraries

Крупномасштабная Экраны метагеномных библиотеки

Metagenomic libraries archive large fragments of contiguous genomic sequences from microorganisms without requiring prior cultivation.  Generating a ...

Isolation of Genomic DNA from Mouse Tails

Выделение геномной ДНК из хвостов мышей

Technical Demonstration of Whole Genome Array Comparative Genomic Hybridization

Техническая демонстрация полного генома массива Сравнительный геномной гибридизации

Array comparative genomic hybridization (array CGH) is a method for detecting gains and losses of DNA segments or gene dosage in the genome 1.  Recent ...

Fabrication and Operation of an Oxygen Insert for Adherent Cellular Cultures 

Изготовление и эксплуатация Кислород Вставка для Приверженец клеточных культур

Oxygen is a key modulator of many cellular pathways, but current devices permitting in vitro oxygen modulation fail to meet the needs of biomedical ...

Genomic MRI - a Public Resource for Studying Sequence Patterns within Genomic DNA

Геномная МРТ - общественный ресурс для изучения последовательности Шаблоны в геномной ДНК

Non-coding genomic regions in complex eukaryotes, including intergenic areas, introns, and untranslated segments of exons, are profoundly non-random in ...

Competitive Genomic Screens of Barcoded Yeast Libraries

Конкурентные Геномная Экраны Barcoded Библиотеки дрожжей

By virtue of advances in next generation sequencing technologies, we have access to new genome sequences almost daily.  The tempo of these advances is ...

Array Comparative Genomic Hybridization (Array CGH) for Detection of Genomic Copy Number Variants

Array Comparative Genomic Hybridization Array CGH for Detection of Genomic Copy Number Variants

Массив сравнительная геномная гибридизация (Array CGH) для обнаружения геномной количество копий Варианты

Array CGH for the detection of genomic copy number variants has replaced G-banded karyotype analysis. This paper describes the technology and its ...

3' End Sequencing Library Preparation with A-seq2

3' конца последовательности подготовки библиотека с A-seq2

Studies in the last decade have revealed a complex and dynamic variety of pre-mRNA cleavage and polyadenylation reactions. mRNAs with long 3&#39; ...

A Two-Step Strategy that Combines Epigenetic Modification and Biomechanical Cues to Generate Mammalian Pluripotent Cells

Двухэтапная стратегия, которая сочетает эпигенетическую модификацию и биомеханические сигналы для создания плюрипотентных клеток млекопитающих

Cell phenotype can be reversed or modified with different methods, with advantages and limitations that are specific for each technique. Here we describe ...

A Robust Method for the Large-Scale Production of Spheroids for High-Content Screening and Analysis Applications

Надежный метод крупномасштабного производства сфероидов для скрининга и анализа с высоким содержанием

High-content screening (HCS) and high-content analysis (HCA) are technologies that provide researchers with the ability to extract large-scale ...