Name: large insert environmental genomic library production
Uploaded: 2009-09-23T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Large Insert Environmental Genomic Library Production at JoVE.com

Yenilik, British Columbia Bilgi Kalkınma Fonu ve Ulusal Bilimler ve Mühendislik Araştırma Konseyi (NSERC) Kanada Kanada Vakfı Biz, kıyı ve açık okyanus sularında düşük oksijen bölgelerde devam eden çalışmalar destek için teşekkür etmek istiyorum. MT ve SL Mikrobiyal Çeşitlilik ve Evrim (CMDE) TULA vakıf tarafından finanse edilen Merkezi burs tarafından desteklenmiştir. MT de Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) burs desteği aldı.

Fosmid kütüphane yapımı dört ana adımları ve çeşitli parçalar (genel bir bakış için bkz: Şekil 1) alt gruplara ayrılmaktadır ayrılmıştır . Adım ([3] &quot;0.22 mcM Sterivex filtreler DNA ekstraksiyonu&quot; protokol bakın) Bölüm 1: Enzim-katalizli hücre parçalama Bölüm 2: CSCL yoğunluk gradiyenti santrifüj ve DNA kurtarma çevre DNA saflaştırılması Bölüm 3: Kalite ...

<ol>
	<li>Zaikova, E., Hawley, A., Walsh, D. A., Hallam, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seawater+sampling+and.">Seawater sampling and.</a> J Vis Exp. , (2009).</li><li>Walsh, D. A., Zaikova, E., Hallam, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large+volume+(20L+)+filtration+of+coastal+seawater+samples.">Large volume (20L+) filtration of coastal seawater samples.</a> J Vis Exp. 28, (2009).</li><li>Wright, J. J., Lee, S., Zaikova, E., Walsh, D. A., Hallam, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+Extraction+from+0.22+&#956;M+Sterivex+Filters+and+Cesium+Chloride+Density+Gradient+Centrifugation.">DNA Extraction from 0.22 &#956;M Sterivex Filters and Cesium Chloride Density Gradient Centrifugation.</a> J Vis Exp. 31, 10-3791 (2009).</li><li>Stein, J. L., Marsh, T. L., Wu, K. Y., Shizuya, H., DeLong, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+uncultivated+prokaryotes:+isolation+and+analysis+of+a+40-kilobase-pair+genome+fragment+from+a+planktonic+marine+archaeon.">Characterization of uncultivated prokaryotes: isolation and analysis of a 40-kilobase-pair genome fragment from a planktonic marine archaeon.</a> J. Bacteriol. 178, 591-599 (1996).</li><li>B&#233;j&#224;, O., Suzuki, O., Koonin, M. T., Aravind, E. V., Hadd, L., Nguyen, L. P. A., Villacorta, R., Amjadi, M., Garrigues, C., Jovanovich, S. B., Feldman, R. A., DeLong, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+and+analysis+of+bacterial+artificial+chromosome+libraries+from+a+marine+microbial+assemblage.">Construction and analysis of bacterial artificial chromosome libraries from a marine microbial assemblage.</a> Environ. Microbiol. 2, 516-529 (2000).</li><li>DeLong, E. F., Preston, C. M., Mincer, T., Rich, V., Hallam, S. J., Frigaard, N. -. U., Martinez, A., Sullivan, M. B., Edwards, R., Brito, B. R., Chisholm, S. W., Karl, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Community+genomics+among+stratified+microbial+assemblages+in+the+Ocean's+interior.">Community genomics among stratified microbial assemblages in the Ocean's interior.</a> Science. 311, 496-503 (2006).</li><li>Hallam, S. J., Putnam, N., Preston, C. M., Detter, J. C., Rokhsar, D., Richardson, P. M., DeLong, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reverse+methanogenesis:+testing+the+hypothesis+with+environmental+genomics.">Reverse methanogenesis: testing the hypothesis with environmental genomics.</a> Science. 305, 1457-1462 (2004).</li></ol>

Bir prosedür nasıl bir kıyı su numunesi elde edilen genomik DNA ile büyük bir takın fosmid kütüphane oluşturmak için en verimli şekilde açıklanmıştır. Up-stream genomik DNA ekstraksiyonu ayrı bir protokol [3] açıklanmıştır. Fosmid-kütüphane üretim çok adımlı bir süreç, planı dört sunulan adımları da dahil olmak üzere tüm prosedürü için en az 2-3 hafta süre. Genomik DNA ekstraksiyonu, en önemli adım ve tüm aşağı akım adımları çıkarılan geno...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Step II</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>CopyControl&trade; Fosmid Library Production Kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>EPICENTRE</td>
<td>CCFOS110</td>
<td>sufficient to generate 9-10 fosmid libraries</td>
</tr>
<tr>
<td>SeaPlaque Agarose</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Cambrex</td>
<td>50100</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>stirring hot plate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Corning</td>
<td>PC-420D</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>1.0X TAE running buffer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>CHEF Mapper XA pulsed field electrophoresis system including cooling module and variable speed pump</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Bio-Rad</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>&lambda; DNA-HindIII Digest</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>NEB</td>
<td>N3012S</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>MidRange I PFG Marker</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>NEB</td>
<td>N3551S</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>10,000X SYBR Gold</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>S11494</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>microwavable plastic wrap</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Saran premium wrap</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Safe Imager transilluminator</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>S37102</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>GELase Agarose Gel-Digesting Preparation</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>EPICENTRE</td>
<td>G09100</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>scalpel</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>08-927-5D</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Unit with Ultracel-10 membrane</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Millipore</td>
<td>UFC801024</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Microcon YM-30 Centrifugal Filter Unit </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Millipore</td>
<td>42410</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>nuclease free water</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Ambion</td>
<td>AM9932</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit *2000 assays*#</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>P7589</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>digital dry block heater</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR</td>
<td>12621-088</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>water bath</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR</td>
<td>14231-854</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>centrifuge</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Beckman Coulter</td>
<td>Avanti J-E</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>centrifuge rotor</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Beckman Coulter</td>
<td>JA 5.3</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>table top centrifuge</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Eppendorf</td>
<td>5415D</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>microcentrifuge tubes, 1.7 mL, clear</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Axygen</td>
<td>MCT-175-C</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>15 mL centrifuge tubes </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher-Corning</td>
<td>430052</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Step III</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>LB broth</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>BP 1426-2</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>MgSO4</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>M2643</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>phage dilution buffer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>10 mM Tris-HCl [pH 8.3], 100 mM NaCl, 10 mM MgCl2</td>
</tr>
<tr>
<td>cryogenic vials</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher-Corning</td>
<td>430488</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Step IV</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>96 well plate with lid</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher-Corning</td>
<td>CS003370(3370)</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>384 well plate with lid</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher-Corning</td>
<td>07201157(3680)</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Petri dishes 100 O.D. x 15mm H</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>08-757-12</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Petri dishes 150 Dia. x 15mmH</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>08-757-14</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>BD Falcon BioDish XL 245 X 245 mm</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR</td>
<td>CABD351040</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>glycerol</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>G5516</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>chloramphenicol</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>C0378</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>LB broth</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>BP 1426-2</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Difco Agar</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD</td>
<td>214530</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>glass beads</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>10-310-1</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>QFill3</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Genetix</td>
<td>X3050</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Bleach</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Javex</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Ethanol</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>E7023</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>15 mL centrifuge tubes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher-Corning</td>
<td>430052</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>QPix colony picker</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Genetix</td>
<td>QPix2</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>picking head (E. coli) </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Genetix</td>
<td>X4006</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

large insert environmental genomic library production

Doğada mikropların büyük bir çoğunluğu şu anda, geleneksel tarım yöntemleri erişilemez kalır. Geçtiğimiz on yıl boyunca, kültür-bağımsız çevre genomik (<em&gt; Yani</em&gt; Metagenomic) yaklaşımları, araştırmacılar, bu kültür ortamında doğrudan yerli mikrobiyal toplulukların genetik içeriği yakalayarak köprü sağlayan ortaya çıkmıştır. Bu amaçla, genomik DNA kütüphaneleri de olsa standart sanatsal laboratuar klonlama teknikleri kullanılarak inşa edilmektedir. Burada mevsimsel hipoksik fiyort dikey derinliği süreklilik elde edilen DNA ile büyük bir ekleme çevre genomik fosmid kütüphane yapım açıklar. Bu protokol doğrudan kıyı deniz suyu örnekleme [1] bağlı protokoller de dahil olmak üzere bir dizi bağlı mikrobiyal biyokütle, büyük hacimli filtrasyon [2] ve bir DNA ekstraksiyonu ve saflaştırma protokol [3]. Başlangıçta, yüksek kalitede genomik DNA 5-fosforile künt biter oluşturulması ile sona onarılmıştır. End-DNA tamir boyutu seçimi ve jel çıkarma, 30 ve 60 bin baz çiftinden (Kb) uzunluğu arasında DNA parçaları kurtarmak için yapılır pulsed-field jel elektroforezi (PFGE) tabi tutulur. Boyutu seçilen DNA PFGE jel matris uzak saflaştırılmış ve künt uç fosfataz tedavi fosmid CopyControl vektör pCC1 (Epicentre bağlandı.<a href="http://www.epibio.com/item.asp?ID=385"&gt; Http://www.epibio.com/item.asp?ID=385</a&gt;). PCC1 ve insert DNA Lineer concatemers sonradan faj dayanıklı sonraki enfeksiyonu ile lambda terminase faj parçacıkları içine paketlenmiş headfull<em&gt; E. coli</em&gt; Hücreler. Başarıyla transduced klonlar antibiyotik seçimi altında LB agar plaklarına kurtarıldı ve robot alarak otomatik bir koloni (Qpix2, GENETIX) kullanarak 384 plaka biçimi arşivlenir. Mevcut protokol Epicentre CopyControl Fosmid Kütüphane Üretim Seti de dahil olmak üzere çeşitli kaynaklardan çizer ve birden fazla araştırma grupları yayınlanan eserler [4-7]. Her adım, akılda en iyi uygulamalar ile sunulmuştur. Genel kütüphane üretim kalitesini ve verimliliğini artırmak için yürütme inceliklerini vurgulamak Mümkün olduğunda. Dahil pek çok kuluçka adımları olduğu gibi, fosmid kütüphane üretim ve otomatik koloni toplama tüm süreç en az 7-10 gün sürer. Ancak, protokol içinde belirtilen olası birkaç durak noktaları vardır.

Watch this Scientific Journal Video about Large Insert Environmental Genomic Library Production at JoVE.com

Large Insert Environmental Genomic Library Production

Mevsimsel hipoksik fiyort dikey derinliği süreklilik çevre genomik DNA izole bir fosmid kütüphane inşaatı açıklanmıştır. Çıkan klon kütüphanesi 384-kuyucuğu içine aldı ve mansap sıralama ve fonksiyonel tarama, otomatik bir koloni toplama sistemi uygulama tarafından arşivlenir.

Büyük Ekle Çevre Genomik Kütüphane Üretim

The vast majority of microbes in nature currently remain inaccessible to traditional cultivation methods. Over the past decade, culture-independent ...

Research

JoVE Journal

Biology

Large-Scale Screens of Metagenomic Libraries

Metagenomic Kütüphaneler Büyük Ölçekli Ekranlar

Metagenomic libraries archive large fragments of contiguous genomic sequences from microorganisms without requiring prior cultivation.  Generating a ...

Isolation of Genomic DNA from Mouse Tails

Fare Tails Genomik DNA izolasyonu

Technical Demonstration of Whole Genome Array Comparative Genomic Hybridization

Tüm Genom Dizisi Karşılaştırmalı Genomik Hibridizasyon Teknik gösteri

Array comparative genomic hybridization (array CGH) is a method for detecting gains and losses of DNA segments or gene dosage in the genome 1.  Recent ...

Fabrication and Operation of an Oxygen Insert for Adherent Cellular Cultures 

İmalat ve Operasyon yapışkan Hücresel Kültürler Oksijen Ekle

Oxygen is a key modulator of many cellular pathways, but current devices permitting in vitro oxygen modulation fail to meet the needs of biomedical ...

Genomic MRI - a Public Resource for Studying Sequence Patterns within Genomic DNA

MR Genomik - Sıra Desenler Genomik DNA içinde incelenmesi için Kamu Kaynak

Non-coding genomic regions in complex eukaryotes, including intergenic areas, introns, and untranslated segments of exons, are profoundly non-random in ...

Competitive Genomic Screens of Barcoded Yeast Libraries

Barkodlu Maya Kütüphaneler Rekabet Genomik Ekranlar

By virtue of advances in next generation sequencing technologies, we have access to new genome sequences almost daily.  The tempo of these advances is ...

Array Comparative Genomic Hybridization (Array CGH) for Detection of Genomic Copy Number Variants

Array Comparative Genomic Hybridization Array CGH for Detection of Genomic Copy Number Variants

Genomik Kopya Sayısı Variantların Algılama için dizi Karşılaştırmalı Genomik Hibridizasyon (CGH Array)

Array CGH for the detection of genomic copy number variants has replaced G-banded karyotype analysis. This paper describes the technology and its ...

3' End Sequencing Library Preparation with A-seq2

A-seq2 ile kütüphane hazırlık sıralama 3' ucu

Studies in the last decade have revealed a complex and dynamic variety of pre-mRNA cleavage and polyadenylation reactions. mRNAs with long 3&#39; ...

A Two-Step Strategy that Combines Epigenetic Modification and Biomechanical Cues to Generate Mammalian Pluripotent Cells

Memeli Pluripotent Hücreleri Üretmek için Epigenetik Modifikasyonu ve Biyomekanik İpuçlarını Birleştiren İki Adımlı Bir Strateji

Cell phenotype can be reversed or modified with different methods, with advantages and limitations that are specific for each technique. Here we describe ...

A Robust Method for the Large-Scale Production of Spheroids for High-Content Screening and Analysis Applications

Yüksek İçerikli Tarama ve Analiz Uygulamaları için Büyük Ölçekli Sferoid Üretimi için Sağlam Bir Yöntem

High-content screening (HCS) and high-content analysis (HCA) are technologies that provide researchers with the ability to extract large-scale ...