Name: tracking dynamics of muscle engraftment in small animals by in vivo fluorescent imaging
Uploaded: 2009-09-21T15:00:00
Duration: 8 min 15 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Tracking Dynamics of Muscle Engraftment in Small Animals by In Vivo Fluorescent Imaging at JoVE.com

Arbetet med Z-Yang och Y Wang har gjorts möjlig genom bidrag K02 AR051181 från NIAMS / NIH anslag från muskeldystrofi Association och Harvard Stem Cell Institute för Y Wang. Arbetet med Q Zeng och X Xu stöds av ett program för bidrag som beviljas för optisk avbildning Lab från Brigham and Women sjukhus. Författarna vill tacka Wen Liu från Department of anestesi, BWH för teknisk hjälp i cell arbete.

Cellberedningen <ol><li> Satellit-cell isolering <ol style="list-style-type:lower-alpha;"><li> Under bedövning, är lem muskler GFP transgena möss (C57BL / Ka-βactin-EGFP) bort. Efter skär i små bitar, satellit-cellerna enzymatiskt dissocierade genom inkubering av malet vävnaden med 2% dispase kollagenas lösning under 1 timme vid 37 ° C. </li><li> Neutralisera enzymet uppslutning med tillväxt media som innehåller Ham F-10 och 20% FBS, särskilja muskeln genom upprepad finfördelande med en pasteurpipett. Cellerna är filtrerad genom en cell sil (Ø70-100μm) och sedan pläterade på icke-coated fat under 1 timme vid 37 ° C. </li><li> Ta försiktigt bort supernatanten och platta dem på en kollagen bestruket maträtt. Upprepa detta steg 1 timme senare för att rena myoblasts. (Pre-platta) </li><li> Byt media och platta celler i tiden. Den slutliga renade myoblasts odlas i medium som innehåller Ham F-10, 20% FBS, 100 U / ml penicillin, och 100 mikrogram / ml streptomycin (tillväxt medium) vid 37 ° C med 5% CO2, 95% luft. </li></ol> </li><li> Kultur och expandera den primära myoblasts tillväxt medium med tillsats av grundläggande FGF på 10 ng / ml. </li><li> För alla in vivo-experiment, injicera vi 5x10 5 celler per TA muskler. </li><li> Vid skörd av myoblasts, lossa vi cellerna genom att använda 0,25% trypsin / EDTA och tvätta dem med PBS två gånger. I cell nummer räknas med hemocytometer och cellerna är suspenderade i HBSS vid en koncentration av 5x10 4 celler / mikroliter. Den koncentrerade celler i HBSS läggs på is och injiceras inom 1 timme efter provtagningen. </li></ol> In Vivo Imaging <ol><li> Man mdx möss i en ålder av 4-6 veckor köps från Jackson labb och underhålls på ett djurstall anläggning. </li><li> Efter ungefär en veckas boende till miljön, möss är redo att implanteras med odlade celler. </li><li> Innan celltransplantation är musen bedövas genom en intraperitoneal (ip) injektion av en blandning av Ketamin (100 mg / kg) och Xylazine (10 mg / kg). Då håret runt TA muskeln område tas bort genom att Nair på benet och vänta i 30 sekunder för att torka rent med destillerat vatten. </li><li> Även musen är fortfarande under narkos, är 5x10 5 celler i 10μl HBSS långsamt injiceras i varje TA muskel på 3 poäng med en 30 gauge nål. </li><li> Efter steg 4, kan musen regelbundet avbildas av in vivo fluorescens avbildning. Den fluorescens avbildning stationen Nightowl LB981 (Berthold Technologies, Inc.), utrustad med en högkänslig charge-coupled kamera används för att få bilder från hindra benen på möss. </li><li> På dagen för in vivo imaging, kontrollerar vi först hår återväxt på TA muskeln. Om det behövs, vi ny ansökan Nair att ta bort hår som beskrivits ovan, efter anesthetizing musen med den blandning av ketamin och xylazin. </li><li> Medan musen är under narkos, placerar vi musen i en utsatt position på en bit svart icke fluorescerande papper (svart Artagain papper från Strathmore). För att till fullo avslöja TA muskeln för bättre avbildning, tejp vi hinden tassar på papperet. </li><li> Vi lägger musen i bildbehandling kammare och placera bakben som ska avbildas i centrum av synfältet på kameran. Vi först växla ut utsläpp filtret för att ta en traditionell gråskala fotografisk bild av benet med en exponeringstid på 5 sekunder. Justera positionen för musen och fokus på kameran om det behövs. Den avbildning parametrar inklusive exponeringstid (1250 ms), prov höjd (0,9 cm) etc. hålls konstanta i den experimentella processen. </li><li> Vi växlar sedan i lämpliga utsläppsnormer filtret för det grönt fluorescerande proteinet våglängd. Vi tar fluorescens bild med en exponeringstid på 1250 ms och en binning antal 1. Efter avbildning, är musen bort från avbildning kammaren till en bur att vänta återhämtning. </li><li> För analys, drar vi en region av intresse (ROI) över fluorescerande signaler för att mäta deras intensitet i form av fotoner per sekund. Vi mäter också storleken på ROI i termer av antalet pixlar som en annan kvantifiering värde. Den avbildning experimenten kan upprepas varje vecka eller oftare under ett par månader, om det behövs, att förvärva longitudinella data. </li></ol> I slutet av experiment, är musen euthanized och TA muskler skördas för histologi analys.

<ol>
	<li>Ballou, B., Ernst, L. A., Waggoner, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+imaging+of+tumors+in+vivo.">Fluorescence imaging of tumors in vivo.</a> Curr Med Chem. 12, 795-805 (2005).</li><li>Green, . <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=fluorescent+protein+as+a+marker+for+gene+expression.">fluorescent protein as a marker for gene expression.</a> Science. 263, 802-805 (1994).</li><li>Godavarty, A., Sevick-Muraca, E. M., Eppstein, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+fluorescence+lifetime+tomography.">Three-dimensional fluorescence lifetime tomography.</a> Med Phys. 32, 992-1000 (2005).</li><li>Graves, E. E., Weissleder, R., Ntziachristos, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+molecular+imaging+of+small+animal+tumor+models.">Fluorescence molecular imaging of small animal tumor models.</a> Curr Mol Med. 4, 419-430 (2004).</li><li>Graves, E. E., Yessayan, D., Turner, G., Weissleder, R., Ntziachristos, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+in+vivo+fluorochrome+concentrations+measured+using+fluorescence+molecular+tomography.">Validation of in vivo fluorochrome concentrations measured using fluorescence molecular tomography.</a> J Biomed Opt. 10, 44019-44 (2005).</li><li>Gurfinkel, M., Ke, S., Wen, X., Li, C., Sevick-Muraca, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Near-infrared+fluorescence+optical+imaging+and+tomography.+Dis+Markers.">Near-infrared fluorescence optical imaging and tomography. Dis Markers.</a> , 107-121 .</li><li>Lee, J., Sevick-Muraca, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+fluorescence+enhanced+optical+tomography+using+referenced+frequency-domain+photon+migration+measurements+at+emission+and+excitation+wavelengths.">Three-dimensional fluorescence enhanced optical tomography using referenced frequency-domain photon migration measurements at emission and excitation wavelengths.</a> J Opt Soc Am A Opt Image Sci Vis. 19, 759-771 (2002).</li><li>Xu, X., Yang, Z., Liu, Q., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+fluorescence+imaging+of+muscle+regeneration+by+transplanted+eGFP-labeled+myoblasts.">In vivo fluorescence imaging of muscle regeneration by transplanted eGFP-labeled myoblasts.</a> , (1985).</li><li>Hoffman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+cell+biology+of+cancer+cells+visualized+with+fluorescent+proteins.">In vivo cell biology of cancer cells visualized with fluorescent proteins.</a> Curr Top Dev Biol. 70, 121-144 (2005).</li><li>Coulton, G. R., Morgan, J. E., Partridge, T. A., Sloper, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mdx+mouse+skeletal+muscle+myopathy:+I.+A+histological,+morphometric+and+biochemical+investigation.">The mdx mouse skeletal muscle myopathy: I. A histological, morphometric and biochemical investigation.</a> Neuropathol Appl Neurobiol. 14, 53-70 (1988).</li><li>Morgan, J. E., Partridge, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Muscle+satellite+cells.">Muscle satellite cells.</a> Int J Biochem Cell Biol. 35, 1151-116 (2003).</li><li>Mendell, J. R., Kissel, J. T., Amato, A. A., King, W., Signore, L., Prior, T. W., Sahenk, Z., Benson, S., McAndrew, P. E., Rice, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myoblast+transfer+in+the+treatment+of+Duchenne's+muscular+dystrophy.">Myoblast transfer in the treatment of Duchenne's muscular dystrophy.</a> N Engl J Med. 333, 832-838 (1995).</li><li>Bogdanovich, S., Perkins, K. J., Krag, T. O., Khurana, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutics+for+Duchenne+muscular+dystrophy:+current+approaches+and+future+directions.">Therapeutics for Duchenne muscular dystrophy: current approaches and future directions.</a> J Mol Med. 82, 102-115 (2004).</li><li>Morgan, J. E., Coulton, G. R., Partridge, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mdx+muscle+grafts+retain+the+mdx+phenotype+in+normal+hosts.">Mdx muscle grafts retain the mdx phenotype in normal hosts.</a> Muscle Nerve. 12, 401-409 (1989).</li><li>Sherwood, R. I., Christensen, J. L., Weissman, I. L., Wagers, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determinants+of+skeletal+muscle+contributions+from+circulating+cells,+bone+marrow+cells,+and+hematopoietic+stem+cells.">Determinants of skeletal muscle contributions from circulating cells, bone marrow cells, and hematopoietic stem cells.</a> Stem Cells. 22, 1292-1304 (2004).</li><li>Cerletti, M., Jurga, S., Witczak, C. A., Hirshman, M. F., Shadrach, J. L., Goodyear, L. J., Wagers, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient,+functional+engraftment+of+skeletal+muscle+stem+cells+in+dystrophic+muscles.">Highly efficient, functional engraftment of skeletal muscle stem cells in dystrophic muscles.</a> Cell. 134, 37-47 (2008).</li></ol>

Vi satte upp en tillförlitlig och stabil avbildning plattform för att spåra fluorescens märkt transplanterade cellerna i mottagarländerna skelettmuskulaturen i denna studie. GFP-märkta myoblasts från GFP transgen mus stöd för en typ av stamceller som kommer att vara kandidater för cellterapi i framtiden. En ständig manipulation, inklusive mobilnummer, cell injektion, tydlig bakgrund, bildbehandling position och maskinens parameter är viktig för att få hög bildkvalitet och speciellt för kvantitativ analys. Fluorescens avbildning har många användningsområden inom den biomedicinska forskningen eftersom den är icke-invasiv, lätt att använda, och har en hög genomströmning. Dessutom fluorescens avbildning kan ge ett kvantitativt mått baserat på fotonen räknas, men på grund av spridning, dämpning och absorption kan ljuset tränga in inte ett stort avstånd i vävnad, vilket är en brist av tekniken. Insatser har pågått för att använda röd eller nära infraröda reporter att öka penetration av ljus. En annan fördel med fluorescens avbildning är att det är att överföra till kliniker om den specifika fluorescerande reporter är godkänd för humant bruk. Jämfört med MR, CT och PET har fluorescens avbildning hög flexibilitet, eftersom det inte kräver dyr hårdvara och agenter avbildning. Ett exempel är fluorescens-baserade endoskop och mikro-endoskop som har använts på kliniker. Genom att kombinera fluorescens avbildning med andra modaliteter, förväntar vi oss att få möjlighet att få både anatomisk och funktionell information om de underliggande biologiska processerna.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>NightOwl LB981</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Berthold Technologies</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

tracking dynamics of muscle engraftment in small animals by in vivo fluorescent imaging

Muskeldystrofi är en grupp av degenerativa muskel sjukdomar som kännetecknas av progressiv förlust av kontraktila muskelceller. För närvarande finns ingen botande behandling att tillgå. Senaste framstegen inom stamcellsbiologi har genererat nya förhoppningar för att utveckla effektiva cellbaserade terapier för behandling av dessa sjukdomar. Transplantation av olika typer av stamceller märkta med fluorescerande proteiner i musklerna dystrofa djurmodeller har använts i stort sett i fält. En icke-invasiv teknik med möjlighet att spåra de transplanterade celler öde längden kan ytterligare vår förmåga att bedöma muskler engraftment av transplanterade celler mer noggrant och effektivt. I den aktuella studien visar vi att in vivo fluorescens avbildning är en känslig och tillförlitlig metod för att spåra transplanterade GFP (grönt fluorescerande protein)-märkta celler i musen skelettmuskulaturen. Trots den oro bakgrunden på grund av användningen av ett externt ljus som behövs för excitation av fluorescerande proteinet, fann vi att med hjälp av antingen naken mus eller eliminera hår med reagenser hårborttagning mycket av detta problem elimineras. Med hjälp av en CCD-kamera, kan fluorescerande signal detekteras i tibialis anterior (TA) efter injektion av 5 x 10 5 celler från antingen GFP transgena möss eller EGFP transduced myoblast kultur. För mer ytliga muskler som extensor digitorum longus (EDL), injektion av färre celler ger en detekterbar signal. Signalstyrka kan mätas och kvantifieras som antalet utsända fotoner per sekund i en region av intresse (ROI). Eftersom de förvärvade Bilderna visar tydliga gränser som avgränsar engrafted området, kan storleken på ROI mätas också. Om ben placeras konsekvent varje gång, förändringarna i antalet fotoner per sekund per muskel och storlek på ROI återspegla förändringarna i antalet engrafted celler och storleken på engrafted området. Därför är de förändringar i samma muskel över tiden kan kvantifieras. In vivo fluorescerande bildteknik har använts främst för att spåra tillväxten av tumorogenic celler, visar vår studie att det är ett kraftfullt verktyg som ger oss möjlighet att spåra öde transplanterade stamceller.

Watch this Scientific Journal Video about Tracking Dynamics of Muscle Engraftment in Small Animals by In Vivo Fluorescent Imaging at JoVE.com

Tracking Dynamics of Muscle Engraftment in Small Animals by In Vivo Fluorescent Imaging

Vi beskriver ett<em&gt; In vivo</em&gt; Fluorescens bildprotokoll att övervaka muskel förnyelse av GFP-märkta myoblasts efter transplantation till skelettmuskulaturen av både friska och dystrofisk möss. Detta protokoll kan anpassas för att studera muskler förnyelse genom transplantation av andra typer av celler och i andra muskulös förhållanden.

Spårning Dynamics of Muscle engraftment i Small Animals av In Vivo Lysrör Imaging

Muscular dystrophies are a group of degenerative muscle diseases characterized by progressive loss of contractile muscle cells. Currently, there is no ...

Research

JoVE Journal

Biology

Tracking Dynamics of Muscle Engraftment in Small Animals by In Vivo Fluorescent Imaging

In vivo Micro-circulation Measurement in Skeletal Muscle by Intra-vital Microscopy

In vivo Micro-cirkulation Mätning i skelettmuskel genom Intra-vitala Mikroskopi

BACKGROUND: Regulatory factors and detailed physiology of in vivo microcirculation have remained not fully clarified after many different modalities of ...

Labeling hESCs and hMSCs with Iron Oxide Nanoparticles for Non-Invasive in vivo Tracking with MR Imaging

Märkning hESCs och hMSCs med nanopartiklar av järnoxid för icke-invasiv in vivo-spårning med MR

In recent years, stem cell research has led to a better understanding of developmental biology, various diseases and its potential impact on regenerative ...

Live Cell Imaging of F-actin Dynamics via Fluorescent Speckle Microscopy (FSM)

Live Cell Imaging of F-actin Dynamics via Fluorescent Speckle Microscopy FSM

Levande cell imaging av F-aktin Dynamics via Fluorescent Speckle Mikroskopi (FSM)

In this protocol we describe the use of Fluorescent Speckle Microscopy (FSM) to capture high-resolution images of actin dynamics in PtK1 cells. A unique ...

Evaluation of Muscle Function of the Extensor Digitorum Longus Muscle Ex vivo and Tibialis Anterior Muscle In situ in Mice

Evaluation of Muscle Function of the Extensor Digitorum Longus Muscle Ex vivo and Tibialis Anterior Muscle In situ in Mice

Utvärdering av muskelfunktion i extensor digitorum longus-muskeln<em&gt; Ex vivo</em&gt; Och tibialis anterior Muscle<em&gt; In situ</em&gt; I möss

Body  movements are mainly provided by mechanical function of skeletal muscle. Skeletal  muscle is composed of numerous bundles of myofibers that are ...

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

In vivo Klon Spårning av hematopoetiska stam och progenitorceller märkta med fem fluorescerande proteiner med hjälp Konfokal och multifoton mikroskopi

We developed and validated a fluorescent marking methodology for clonal tracking of hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) with high spatial and ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

In Vivo 4-Dimensional Spårning av Hematopoietic Stem och stamceller i vuxen mus calvarial Benmärg

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

High-resolution Time-lapse Imaging and Automated Analysis of Microtubule Dynamics in Living Human Umbilical Vein Endothelial Cells

Högupplöst time-lapse avbildning och automatiserad analys av mikrotubuli Dynamics i Living Human navelsträngsvenendotelceller

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes ...

A Graphical User Interface for Software-assisted Tracking of Protein Concentration in Dynamic Cellular Protrusions

En grafisk användargränssnitt för programvaruassisterad spårning av proteinkoncentration i dynamiska cellulära protrusioner

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex ...

Real Time In Vivo Tracking of Thymocytes in the Anterior Chamber of the Eye by Laser Scanning Microscopy

Real Time In Vivo Tracking of Thymocytes in the Anterior Chamber of the Eye by Laser Scanning Microscopy

In Vivo spårning av tymocyter i främre kammaren i ögat av laserscanning mikroskopi i realtid

The purpose of the method being presented is to show, for the first time, the transplant of newborn thymi into the anterior eye chamber of isogenic adult ...

Examination of Mitotic and Meiotic Fission Yeast Nuclear Dynamics by Fluorescence Live-cell Microscopy

Undersökning av mitotiska och Meiotic fission jäst nukleär dynamik genom fluorescens Live-cell Microscopy

Live-cell imaging is a microscopy technique used to examine cell and protein dynamics in living cells. This imaging method is not toxic, generally does ...